免疫磁珠的原理與特性及其在動物源性食品檢測中的應用研究

費 楓，黃迅辰

(1.嘉興職業技術學院，浙江嘉興314000; 2.中國計量學院生命科學學院)

免疫磁珠(IMB)簡稱磁珠。免疫磁珠是通過磁場作用特異性分離目的產物的新興技術，具有操作簡便、靈敏度高、耗時少、生物活性強等特點，是近30年發展起來的新型免疫學分離技術，在食品微生物及其毒素、細菌分離、生化及分子遺傳學等領域得到廣泛應用。常用免疫磁珠是超順磁性四氧化三鐵納米磁珠，可通過特殊官能團偶聯抗原或標記物，結合于靶物質，并在外加磁場作用下達到分離、純化的目的。

動物源性食品是指可食用動物的肉、乳、蛋及其制品和副產品。動物源性食品污染通常存在于動物飼養，產品加工、運輸和儲存的各個環節，包括動物飼料中添加劑殘留、農藥殘留、動物體本身的激素和病原微生物等，經常受到加工、運輸過程中的衛生情況和保鮮技術的影響。

對于動物源性食品中的污染物檢測技術通常包括色譜法、質譜法、酶聯免疫檢測法及微生物抑制法等，這些方法大都需要復雜的前處理操作，耗費較長的檢測時間，免疫磁珠檢測技術則因檢測方便、靈敏度高、生物活性強等特點，可以作為動物源性食品污染檢測的新技術。

1 免疫磁珠的原理與特性

1.1 免疫磁珠的原理 據Sandeep Kumar V.等(2003)［1］報道，磁性微球材料的自身屬性決定磁珠的生物活性和毒性，小于100 nm 的磁珠有較大的比表面積，較高的穩定性和擴散性。磁性微球由磁性元素組成，如鐵、鈷、鎳及其化合物。當磁珠粒徑小到臨界尺寸時，無磁場下磁化強度為0，達到超順磁狀態，同時對磁場有很高的靈敏度。

磁性微粒可偶聯高分子聚合物，進而固定化親和吸附、離子交換吸附或疏水作用的免疫配基，形成能特異性結合的復合體免疫磁珠。通過免疫磁珠與靶物質(病原微生物，病毒，細菌，化學物質等)相連，在磁場作用下，將其分離，達到快速、靈敏的富集效果。

1.2 免疫磁珠的特性

1.2.1 磁珠粒徑 磁性微球粒徑均一(10－100 nm)。磁珠粒徑越小飽和磁性越小，吸附效率則越大，具有小尺寸效應和表面效應，呈現新的物理性質。磁珠的球型結構有均勻的成核機制，晶體穩定并可減少不同形狀粒子間的非特異性結合。

1.2.2 磁珠表面基團 磁性微球表面所含的活性基團可用高分子材料進行修飾以提高應用能力。聚甲基丙烯酸甲脂修飾磁性微球可有效抑制磁珠濃縮而沉淀，修飾的磁珠分散性強，溶解能力是未修飾磁珠的25 倍;油酸修飾可改變免疫磁珠極性，增強其在有機溶液中的溶解性;聚乙烯亞胺修飾可使粒徑增大至80 nm，提高磁性微球與免疫配基及其目的捕獲物質的結合效率［2］。

1.2.3 磁珠的特異性 免疫磁珠特異性強，其捕獲目標物質能力取決于免疫配基的特異性。根據磁性微球高分子材料結合的DNA、RNA、抗體、抗原、生物素等不同特異性配基，可應用于不同分離純化。多重DNA 探針與免疫磁珠結合，可用于慢性淋巴細胞性白血病和骨髓增生異常綜合征等血液系統疾病檢測，RNA 固定于免疫磁珠上則可特異性分離細菌，免疫磁珠偶聯生物素可提取分離出某些生物毒素。不同濃度樣品和不同目標物質決定了免疫磁珠制備時不同的結合順序，主要取決于免疫配基與目標物質或磁性微球偶聯的順序。

1.2.4 磁珠的適用性 免疫磁珠自組的磁性微球和免疫配基均具有良好的生物活性和穩定性，且在制備偶聯過程中對其性質不產生影響。通過分離后得到的目標物質再結合ELISA、PCR 等現代檢測技術可有效實現物質的精確分析。免疫磁珠制備所需設備簡單，易操作，在應用過程中選擇性多，適用范圍廣;使用后的免疫磁珠經洗滌后可再生，可有效保存數月后仍可重復使用。

2 免疫磁珠的制備方法

2.1 沉淀法 沉淀法是采用二價鐵和三價鐵堿化沉淀制備出四氧化三鐵。Olowe AA.等(1991)［3］研究發現，反應分為3 個步驟:Fe2++ 2OH－→Fe(OH)2;3Fe(OH)2+1/2O2→Fe(OH)2+2FeOOH+H2O;Fe(OH)2+2FeOOH→Fe3O4+2H2O。lida H.等(2007)［4］采用亞鐵與乙二胺沉淀或亞鐵和三價鐵混合與乙二胺沉淀，表征后生成中間產物γ－Fe2O3，后氧化形成Fe3O4，其粒徑大于混合沉淀制備的四氧化三鐵，且磁性強度更大。Shen YF.等(2009)［5］將亞鐵鹽和鐵鹽混合溶于水溶液中，滴加氨水溶液，室溫下攪拌1 h，再用聚乙二醇－4000 溶液分散黑色膠狀物，氮氣保護下90℃水浴鍋攪拌30 min，洗滌干燥制備得到平均粒徑為12 nm 的納米四氧化三鐵－聚乙二醇微粒，其飽和強度可達到74.3 emu/g，為理論最大值的80%。

2.2 微乳液法 微乳液是由相互不溶的液體形成熱力學穩定的分散體系，微乳液較強的分散能力對納米磁性微球的形成有著重要意義。微乳液表面張力小，增容能力強，形成水包油型(O/W)或油包水型(W/O)微乳液。磁性微球晶體的各向異性直接影響磁珠的超順磁性和阻塞溫度，當微粒達到阻塞溫度時，即可表現出特有的宏觀磁體特性和純量子行為，使之成為適用的免疫磁珠。阻塞溫度取決于分子間偶極作用，而乳膠粒間的相互作用可改變自由能，因此微乳液法能制備出粒徑均一，分散性強的磁性微球。Vidal－Vidal J.等(2006)［6］采用環已胺和油酸作表面活性劑，形成穩定膠狀的油胺－納米磁珠體系，其粒徑分布集中，平均為3.5 ±0.6 nm，但表面修飾的油胺容易被油酸所取代，所以生成的磁性微球純度不高。Yang HH.等(2004)［7］采用反相微乳法制備了SiO2－Fe3O4納米磁珠，用于酶的固定和免疫檢測，球型微粒的平均粒徑為53 ±4 nm，表面積為330 m2/g，SiO2形成的孔徑為1.427 cm3/g，磁飽和強度達到3.2 emu/g。

2.3 凝膠溶膠法 凝膠溶膠法原理是將Fe2+鹽溶液與堿混合形成凝膠網絡狀態，加入溫和氧化劑，通過長時間反應，逐漸形成納米四氧化三鐵，在凝膠網中不聚沉納米四氧化三鐵即為單分散性的磁珠。當納米四氧化三鐵數量增加，凝膠狀態部分溶解，可制備得到粒徑較大的磁珠。凝膠網網絡形成的濃度越大，則納米四氧化三鐵的粒徑越小。Ma M.等(2004)［8］采用凝膠溶膠法，以Fe2+鹽溶液為變量制備出7.5－416 nm 磁性微球，大于46 nm 的磁珠比吸收率隨粒徑的減小而增加，而7.5－13 nm 的磁珠具有超順磁性。

2.4 水熱法 水熱法是以水為反應介質，將Fe3+鹽溶液與還原劑(包括氧化石墨、堿三乙烯四胺、氫氧化鈉等)按比例混合，利用高溫高壓環境使難溶或不溶物質溶解，反應結晶形成納米四氧化三鐵，當反應溫度在130℃－250℃之間，隨著溫度升高可有效提高磁珠磁飽和強度。Fan R.等(2001)［9］將硫化鹽鐵、硫代硫酸鈉、氫氧化鈉混合于蒸餾水中，置高溫釜內，140℃加熱12 h，得到粒徑為50 nm 的逆立方尖晶石結構納米四氧化三鐵，產率高達90%。Yan A.等(2008)［10］采用SDS(十二烷基硫酸鈉)和PEG(聚乙二醇)混合作為表面活性劑，通過控制反應時間、表面活性劑濃度、FeCl3濃度，制備得到15－190 nm 的磁性微球。

2.5 熱分解法 熱分解法主要通過金屬氧化物和表面活性劑混合，高溫加熱得到幾種金屬氧化物的混合物分解產物，這種方法制備的納米四氧化三鐵粒徑與表面活性劑、反應溫度、鐵鹽種類有關。Hua GE.等(2003)［11］將Fe2+鹽溶于聚乙烯醇，加入氨水使之形成含FeOOH 等的復合物，再用100℃持續干燥12 h，最后用600℃處理得到40 nm 的納米四氧化三鐵磁珠。范娜(2007)［12］采用前驅物(Fe－(CP)2)和草酸鈉混合作為前體，600℃持續反應，通過控制(Fe－(CP)2)用量及反應體系(壓力、溫度等)制備了不同形狀和粒徑的納米四氧化三鐵。

3 免疫磁珠在動物源性食品病原微生物污染檢測中的研究進展

食源性微生物是導致食源性疾病的根本原因，嚴重影響食品安全，因此建立食源性微生物檢測技術有著重要意義。應用免疫磁珠技術可以從食品樣品中快速、簡便、特異性的分離出目的微生物，配合常規、標準的檢測方法，從而實現微生物的快速檢測。

3.1 1990年代研究進展 20 世紀90年代，Skjerve E.等(1990)［13］研究了從食品中分離單核細胞增多性李斯特菌，從實驗室篩選出李斯特菌，同時分離出菌體鞭毛，用粒徑大小為2.8μm 的磁珠和羊抗鼠抗體室溫下震蕩反應形成免疫磁珠濃度105/μl PBS溶液。結果表明，李斯特菌吸附濃度同磁珠濃度和時間呈正相關，最低濃度約為1 ×102CFU/mL 至2×102CFU/mL。Patel PD.等(1991)［14］制備出磁性微球－生物素－鏈霉親和素－多克隆抗體的復合免疫磁珠，可檢測出不同食品中沙門氏菌最低濃度為105CFU/g，且將檢測時間從5 ～6 d 縮短到1 ～2 d。Olsvik O 等(1994)［15］提出免疫磁珠檢測包括細菌(大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏桿菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、腸炎弧菌、霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、芽胞桿菌、沙眼衣原體、康氏立克次體等);病毒(腸道病毒、巨細胞病毒、HIV－1、傳染性胰腺壞死病毒);寄生蟲(惡性瘧原蟲、曼氏裂體吸蟲)。Goodridge L.等(1999)［16］檢 測 肉 湯 中 大 腸 桿 菌O157∶H7濃度，首先處理大腸桿菌O157∶H7制備熒光標記噬菌體，通過組裝形成磁性微球－熒光標記噬菌體免疫磁珠，離心分離后用流式細胞術檢測到大腸桿菌為104CFU/mL，通過改進的熒光過濾法可檢測到大腸桿菌的最低濃度為102－103CFU/mL。

3.2 2000年來研究進展 2000年以來，免疫磁珠技術在食源性微生物檢測領域取得了更多突破。Mansfield LP.等(2000)［17］用脫脂奶接種沙門氏菌進行培養，用沙門氏菌特異性單克隆抗體M105 偶聯磁性微球，固定沙門氏菌。進而用ELISA 方法進行鑒定。相比于一般方法需要72－96 h，而此方法則能在24 h 內完成，且最低檢測濃度為105－106CFU/mL。Kumar S.等(2005)［18］用LB 培養基培養傷寒桿菌，用新西蘭大白兔免疫獲得鞭毛蛋白抗血清，交叉反應獲得抗原，用2.8 μm 的磁性微粒，在PBS 中重懸多克隆抗體制備出多抗－免疫磁珠。通過與食品和水樣品孵育捕獲目的微生物，經PCR 鑒定獲得的食源微生物，檢測需3－5 d，傷寒桿菌在肉類和牛奶中達106－108CFU/g，蔬菜中達102CFU/g。Jin SQ.等(2009)［19］建立基于免疫磁珠的高通量檢測系統，可用于檢測金黃色釀膿葡萄球菌、副溶血性弧菌、李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏桿菌、大腸桿菌O157∶H7等。將粒徑大小為250 μm 的磁性微粒用異硫氰酸酯表面修飾，偶聯用氨基修飾的寡核苷酸，置于聚二甲基硅氧烷的微通道中，再將病原體PCR 產物用泵壓入微通道中與免疫磁珠混合。檢測過程靈敏度強，特異性高，能在30 min 內完成，且檢測濃度按照菌屬不同達到500－6000 CFU/mL，可檢測包括牛奶、雞蛋、肉類等動物源性食品。

3.3 近幾年研究進展 近年來，免疫磁珠在食源性微生物研究不斷升溫。Jeníková G.等(2010)［20］用免疫磁珠與沙門氏菌抗體偶聯，對濃縮后的菌體樣本進行處理，將混合溶液用磁場分離免疫磁珠，用乙醇和蒸餾水洗滌數次除去食品殘余和其他微生物，通過PCR 鑒定獲得腸桿菌科中有4 種是非沙門氏菌，有17 種是沙門氏菌。同時將免疫磁珠法與普通離心法對比，免疫磁珠法可將食品中沙門氏菌檢測時間縮短到24 h 以內，快速完成，且可應用于低濃度和菌體種類復雜的食品樣品中。Diler E.等(2011)［21］提出溶菌酶催化中心的突變點影響溶菌酶的催化活性，將其定點突變克隆后，固定在免疫磁珠上，重懸于菌液中，溶菌酶特異性識別細菌細胞壁，將細菌連接在免疫磁珠上，在磁場下將免疫磁珠分離，將細菌洗脫后進一步分析，同時將突變的溶菌酶轉錄于酵母菌中，表達重組蛋白。這一方法能快速有效的從細胞組織中分離細菌。Wang L.等(2012)［22］用熒光納米磁珠檢測牛肉中的大腸桿菌和沙門氏菌，首先將熒光量子點用三氯甲烷溶解，用甲醇洗滌后干燥，然后用二氫硫辛酸脫氫酶溶液攪拌溶解，離心分離，重懸于PBS 緩沖溶液，用0.2 μm針筒過濾器得熒光量子點水溶液。采用間接法先用EDC 和MES 處理得到QD－EDC－蛋白A 復合物，在此基礎上連接抗體DSB－X 生物素。用免疫磁珠處理后作用于牛肉樣品磁場分離，可以檢測到大腸桿菌和沙門氏菌的最低濃度為10 CFU/g。Krizkova S.等(2013)［23］用鋅指蛋白雞抗修飾免疫磁珠，可高效用于富集金黃色釀膿葡萄球菌及其鋅指蛋白，得出捕獲效率與抗體濃度、離子濃度、孵育時間呈相關性，然后用SDS－PAGE 鑒定出用免疫磁珠分離的鋅指蛋白。

4 免疫磁珠在動物源性食品化學污染物檢測中的應用進展

目前，動物源性食品中化學污染問題嚴重，包括有機物或無機物等化學物質，如食品添加劑，重金屬污染，農藥殘留，水體污染等。免疫磁珠分離法在化學污染物的檢測中已得到較好的應用。

4.1 動物源性食品中添加劑檢測 鹽酸克倫特羅俗稱“瘦肉精”，為提高瘦肉率添加于豬飼料中。李超輝等(2013)［24］制備180 nm 納米磁珠－鏈霉親和素－生物素化抗體的免疫磁珠，其中抗體偶聯量為77.2 μg/mg，用于捕獲豬肉勻漿中的克倫特羅，洗脫后用ELISA 方法檢測，免疫磁珠有較大的回收效率。干寧等(2009)［25］用合成的三聚氰胺抗體－納米磁珠－氯代鄰菲噦啉雙核銅配合物免疫磁珠固定于絲網印刷電極(SPCE)表面，構建了一種測定牛奶中三聚氰胺含量的安培免疫傳感器，能檢測的最低濃度為0.25 ng/mL，且檢測時間小于20 min。

4.2 動物源食品中毒素檢測 肉毒神經毒素具有很強的毒性，比氰化物毒性高1000 億倍，由厭氧菌產生在食品中殘留。Singh BR.等(2000)［26］將抗肉毒神經毒素抗體共價結合于納米磁珠上，作用于牛奶樣品中捕獲肉毒神經毒素重鏈，無需受其酶活性影響，避免其內源性蛋白酶和肽酶的作用，能檢測出的最低濃度遠低于正常人攝入量70 μg。金黃色釀膿葡萄球菌能產生約50 種具有廣泛生物活性的毒力因子，其中有21 種已知腸毒素(SEA)，其生物活性、酶活性、抗原活性類似，能引發人體腸道炎和過敏反應。Rasooly R.等(2012)［27］用葡萄球菌腸毒素抗體偶聯免疫磁珠捕獲食品中毒素，洗脫后通過細胞中腫瘤壞死因子定量表達檢測葡萄球菌腸毒素的生物活性。Pauly D.等(2009)［28］用2.8 mm 的磁珠偶聯單克隆抗體和多克隆抗體制備出高通量檢測蓖麻毒素、相思豆毒素、肉毒神經毒素、葡萄球菌腸毒素B 的免疫磁珠，將捕獲靈敏度從2－546 ng/L 的最低飽和濃度線提高到每500 mL 樣品檢出濃度為0.3－ 85 ng/L，能檢測牛奶、嬰兒食品和酸奶等食品。

4.3 動物源性食品中農藥殘留檢測 食品或水體等周圍環境中農藥殘留一直是很受關注的問題，檢測方法手段主要包括放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫技術、酶聯免疫吸附分析法、生物傳感器等。目前免疫磁珠檢測農藥的研究較少，一般同生物傳感器結合進行農藥殘留檢測。莠去津是一種農藥除草劑，易被根系吸收，殘留在植物體內被畜禽攝入，Byzova NA.等(2010)［29］將30 nm 磁珠偶聯抗莠去津單克隆抗體，可以在10 min 內檢測出莠去津最低濃度為130 ng/mL。

5 結 語

免疫磁珠檢測技術效率比一般方法提高6－8倍，對于動物源性食品檢測有著重要意義，可以達到現場檢測的目的。

但是，目前免疫磁珠技術還尚未十分成熟，成型商業化的免疫磁珠檢測技術、檢測試紙、檢測卡等甚少，隨著更多的檢測特異性指標的免疫磁珠開發，免疫磁珠檢測將在動物源性食品的安全控制領域，將可能得到更為廣泛的應用。

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