MicroRNA與缺血性腦卒中關系的研究進展

保玉蓮 綜述 朱榆紅 審閱

1）昆明醫科大學第五附屬醫院神經內科 個舊 661000 2）昆明醫科大學第二附屬醫院神經內科 昆明 650101

MicroRNA是一類真核生物中廣泛存在的內源性、非編碼、單鏈、小分子RNA，長度19～25個核苷酸，這些小分子RNA能夠識別特定的目標mRNA，并在轉錄后水平對基因的表達進行負調控。1993年，Lee RC等［1］發現了第一個能階段性調控胚胎后期發育的基因lin－4，這一發現在當時未引起足夠重視，2000年，Reinhart等［2］又在線蟲C.elegans中發現了第2個異時性開關基因let－7。在此之后，許多研究小組分別在線蟲、果蠅、斑馬魚、擬南芥、水稻和人類等多種真核模式生物和細胞中找到了1 000多個類似的小分子RNA［3］，開啟了人類研究miRNA的里程。在真核細胞內，RNA聚合酶Ⅱ從miRNA編碼基因轉錄出初級轉錄本，即pri－miRNA。在細胞核內，pri－miRNA經過Drosha酶切割成長70～100個堿基、具有發夾結構的miRNA 的前體，即pre－miRNA，pre－miRNA又通過核輸出蛋白（exportin5）轉運到細胞質，被核糖核酸酶（Dicer）切割成19～25個核苷酸大小的成熟雙鏈miRNA產物，然后在解螺旋酶的作用下，雙鏈miRNA解開，其中一條鏈被降解，另一條鏈先后與dicer和ago蛋白結合，形成RNA誘導沉默復合體（RNA－induced silencing complex，RISC），RISC內的 miRNA與靶 mRNA 3’非編碼區（3’－UTR）內特異序列互補結合，影響 mRNA的成熟、轉運及穩定性，或直接調控mRNA的翻譯過程，從而降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯而發揮調控作用［4］。

隨著生命科學的不斷發展和對基因研究的深入探索，對miRNA的研究也越來越多。生物信息學分析顯示，人類約有1／3基因編碼的mRNA受到miRNA的負調控［5］。miRNA不僅參與了細胞的分化、生長、增值及凋亡過程［6］，而且還在一些疾病的發生、發展過程中起著重要的調控作用［7］。

miRNA的分布及表達具有組織特異性，也就是說，機體不同的組織中存在不同高表達量的miRNA。Sempere等［8］首次在人和小鼠的神經細胞中檢測出7個腦組織特異性miRNAs（miR－9、－124a、－124b、－129、－135、－153、－183）。 Hua等［9］對大鼠不同組織中152種miRNAs的表達特異性研究顯示，有30種miRNAs特異性表達于大鼠神經組織中，如let－7、miR－21、－124、－128、－199、－429 等。Linsen等［10］在 大 鼠的腦組織中檢測出了133種miRNAs，而在睪丸和肝臟組織中僅分別發現35種及9種miRNAs，說明大鼠的腦組織中存在數量最多的 miRNA。Weng等［11］研究表明，miR－124、－219、－346是腦組織中表達較豐富的幾類miRNAs，其中以miR－124最具有腦組織特異性，參與了神經元分化、神經生長發育以及腦組織損傷后的調控，通過檢測大腦中動脈阻塞模型的大鼠血漿miR－124濃度，發現miR－124在腦缺血6h后即開始升高，一直持續到48h以后。

隨著人口老齡化和經濟水平的快速發展以及生活方式的改變，人類缺血性腦卒中的發病率明顯上升。不同的發病類型、不同的病因、發病機制、臨床表現，采用不同的治療方法，患者會有不同的預后。

基于上述原因，miRNA與缺血性腦卒中的相關性研究也越來越受到分子生物學家及臨床神經病學家的青睞。目前miRNA與腦血管病的研究才剛剛起步［12］，下面就近年來關于miRNA在缺血性腦卒中幾個重要的病理生理變化過程中的相關性研究做一簡單介紹。

1 miRNA與動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化（AS）是缺血性腦卒中最主要的危險因素，動脈粥樣硬化斑塊的形成是動脈粥樣硬化的標志。內皮細胞損傷、脂質沉著、單核巨噬細胞聚集、吞噬以及炎性反應等是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要過程。

1.1 miRNA與血管內皮細胞內皮細胞功能失調是AS的啟動因素，促進了單核巨噬細胞的聚集、吞噬作用以及細胞外基質的慢性炎癥反應，并導致脂質在內膜下沉積，形成粥樣斑塊。近年來許多研究表明miRNA可參與調控內皮細胞的功能障礙。Qin等［13］研究發現，miR－let－7c可通過抑制Bcl－x1的表達，促進內皮細胞的凋亡而參與促進動脈粥樣硬化的形成。相反地，Zernecke等［14］研究則發現，miR－126可通過加強內皮細胞的修復而發揮抗動脈粥樣硬化的作用。內皮祖細胞是內皮細胞的前體細胞，通過增殖、分化、成熟后，起到修復損傷血管，改善內皮功能的作用。研究發現，冠心病病人的內皮祖細胞數目減少，且其內皮祖細胞中miR－221和miR－222的表達要高于正常人［15］，而應用降脂藥物阿托伐他汀治療后這兩種miRNAs的表達能夠明顯下調，說明miR－221和miR－222參與血脂調節和動脈粥樣硬化斑塊的形成［16－17］。 另 外，Albinsson等［18］研 究 也 指 出，在 動 脈 粥 樣硬化患者中，內皮祖細胞生成的 miR－126、miR－130a、miR－221、miR－222和miR－92a等存在調節失控 。

1.2 miRNA與炎癥炎癥也是動脈粥樣硬化發生、發展過程中一大重要病理基礎。炎癥可導致血管局部單核巨噬細胞浸潤，促進脂質沉積，導致動脈粥樣硬化脂紋等早期病變的產生。近年來研究表明，miRNA亦可通過調節炎癥反應而參與到動脈粥樣硬化過程中來。Zhu等［19］研究表明，miR－155通過炎癥反應相關蛋白編碼基因的轉錄后調控，調節冠狀動脈粥樣硬化的發生、發展。Nazari等［20］研究也證實，miR－155缺失的巨噬細胞中，細胞因子CCL表達減少，可促進單核細胞在粥樣斑塊的聚集。另外，miR－155可通過直接抑制BCL－6的表達，減弱炎癥前因子NF－κB的信號傳導。Nazari等觀察到在BCL－6沉默的大鼠中，miR－155／巨噬細胞的沉著促進了動脈粥樣硬化斑塊的形成和CCL－2的表達，為miR－155調節動脈粥樣硬化提供了有力證據。另外，Wu等［21］通過體內試驗和細胞實驗發現，miR－181a可通過調控c－Fos的表達，抑制DC中氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）觸發的炎癥反應，從而抑制冠狀動脈粥樣硬化的形成。

1.3 miRNA與單核巨噬細胞單核巨噬細胞通過促進炎癥反應、脂質沉積和斑塊破裂，在動脈粥樣硬化發生與發展過程中發揮極其重要的作用。近年來研究表明，miRNA可通過對單核細胞的功能調節而發揮對動脈粥樣硬化的調控作用。巨噬細胞集落刺激因子受體（c－Fms）參與了單核細胞分化成巨噬細胞的過程，在人單核細胞分化的巨噬細胞及動脈粥樣硬化實驗模型中，發現巨噬細胞集落刺因子能上調一些與膽固醇合成有關的基因及一些促進動脈粥樣硬化的細胞因子。miR－124和miR－155已被確定在這一通路中發揮調控作用，研究發現，c－Fms為 miR－155的靶基因，miR－155通過調節c－Fms，抑制單核細胞向巨噬細胞分化，從而減少了巨噬細胞對纖維帽的降解，穩定了粥樣硬化斑塊［22］。巨噬細胞吞噬脂質，促進平滑肌細胞增生、纖維帽形成，故抑制其脂質吞噬能力或提高血漿高密度脂蛋白水平可以延緩動脈粥樣硬化的進程。Rayner等［23］研究發現，給小鼠注入miR－33抑制劑后，三磷酸腺苷依賴的轉錄盒ABCA表達增強，血漿高密度脂蛋白升高，細胞膽固醇外排功能增強，抑制了動脈粥樣斑塊形成。最近，Rayner等［24］進一步以非洲綠猴作為研究對象，注入miR－33抑制劑，12周后也發現血漿中高密度脂蛋白持續升高，動脈粥樣硬化的進程減慢，表明miR－33在脂質代謝及動脈粥樣硬化方面有重要的調節作用。

2 miRNA與腦水腫

腦水腫既是缺血性腦卒中發展到一定階段出現的病理生理改變，也是缺血性腦卒中的重要并發癥。近年來一些研究表明，腦水腫的形成與一些因子的參與有密切的關系，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、水通道蛋白（AQP）等，而研究也證實，miRNA可參與調控這些因子的表達。

2.1 miRNA與基質金屬蛋白基質金屬蛋白（MMPs）通過降解細胞外基質（ECM），破壞ECM的完整性，使血腦屏障通透性增強而引起腦水腫。其中以基質金屬蛋白酶－9（MMP9）與缺血性腦卒中后腦水腫關系最為密切。研究表明，MMP9是 miR－132和 miR－664的靶基因，這2個 miRNAs在急性腦缺血后表達降低，故使MMP9表達增高而促進腦水腫形成。Versican是組成細胞外基質的一種重要的硫酸軟骨素蛋白聚糖，Wang等［25］研究表明，miR－143能夠抑制versican mRNA的翻譯，從而抑制ECM的合成，加重腦水腫。若能減少miR－143的表達，則有可能維持ECM的完整性，減輕腦水腫的產生。

2.2 miRNA與水通道蛋白水通道蛋白（AQP）是一種位于細胞膜上的蛋白質，在細胞膜上組成“孔道”，可控制水在細胞的進出。Sepramaniam等［26］研究提示，大腦組織中水通道蛋白1，4，9（AQP1，4，9）含量比較豐富，參與了血管源性腦水腫的形成。該研究指出，miR－320a通過下調AQP1和AQP4，減輕腦細胞內水的積累，從而起到減輕腦水腫、保護腦細胞的作用。同一時期，Lim等［27］研究也具有同樣結果，他們以大腦中動脈閉塞后腦缺血水腫的大鼠為研究對象，發現miR－320a的表達明顯下調，而此時AQP1和AQP4的表達則明顯增高。AQP4是腦組織中含量最豐富的水通道蛋白，最 近，Sepramaniam 等［28］通 過 miRNA 檢 測 軟 件 （RegRNA 軟 件 ），檢 測 出 有 34 種 miRNAs（miR－130a，－152，－668，－939，－1280等）可與 AQP4的轉錄本（M1）上的啟動子結合，并通過體內實驗研究發現，抑制miR－130a的表達可顯著增加腦組織中AQP4的含量，從而穩定水在腦細胞的進出，減輕腦水腫的發生。

3 miRNA與腦缺血再灌注損傷

缺血性腦卒中后腦組織血供中斷，而盡早恢復血流再通，使缺血腦組織重新得到氧的供應，提供代謝所必需的營養物質并清除代謝產物，是治療的主要目的及手段。然而缺血后的血流再通在某些情況下可導致進一步的組織損傷和功能障礙，這種恢復血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）。IRI主要與氧自由基產生導致細胞毒性、細胞內鈣超載破壞線粒體結構與功能、白細胞增多阻塞毛細血管及高能磷酸化合物缺乏影響能量代謝等因素有關。近年來，對腦缺血再灌注損傷的研究已深入到基因水平，miRNA作為一種重要的基因水平調控因子，對它的研究也相應越來越多。2008年，Jeyaseelan等［29］用基因芯片檢測SD大鼠腦缺血1h，再灌注24h、48h血漿和腦組織中miRNA的表達。結果顯示，再灌注24h后，血漿中miR－19b、－290、－292－5p表達升高，miR－103及 miR－107表達減少，而腦組織中則可檢測出32種miRNAs表達發生變化。再灌注48h后，血漿及腦組織中分別又出現一組新的miRNAs，說明這些miRNAs可能與24h的急性腦缺血性損傷和48h腦缺血逐漸恢復這一病理生理過程有關。結果還顯示，有10種miRNAs在再灌注24h、48h后，在血漿及腦組織中均表達且變化趨勢一致，如miRNA－290在兩個時段都升高，而let－7i表達均降低。這個實驗還說明，miRNAs在缺血再灌注損傷后的表達存在時空特異性。這一點也被Ziu等研究小組證明，他們通過對胎鼠的大腦皮質初級神經元和星形膠質細胞在體外先給予氧糖剝奪處理60min，再將細胞移入正常氧糖培養基中而進行缺血再灌注處理，分別在不同時間點檢測兩種細胞的miRNAs表達，結果發現，神經元細胞中miR－29b在6h后上調2倍，24h后上調4倍，miR－21在24 h后上調2倍，而星形膠質細胞中miR－29b及miR－21僅在12h后才表現為上調，miR－30b、－107、－137在星形膠質細胞中表達出現改變，而在神經元細胞中卻無變化［30］。Yin等［31］應用RT－PCR技術對大腦中動脈閉塞再灌注24h后小鼠大腦皮質miRNAs表達研究發現，miR－497表達較正常組織明顯升高，同時，在體外對小鼠的N2A細胞進行缺氧缺糖處理，再檢測該細胞的miRNAs表達，也發現miR－497表達較未進行缺氧缺糖處理的細胞增高4倍，說明體內或體外的缺血性刺激均可引起miR－497表達的增加?？沟蛲龌騜c1－2／bc1－w是 miR－497的靶基因，腦缺血損傷后，miR－497表達增高，抑制了bc1－2／bc1－w的表達，從而促進腦細胞凋亡。經側腦室灌注antagomir－497后，小鼠大腦中動脈閉塞再灌注模型大腦梗死灶面積減小。近年來國內也有學者在進行有關miRNA與腦缺血再灌注損傷方面的研究，同樣用線栓法建立大鼠大腦中動脈阻塞模型，缺血1.5h，再灌注24 h后用基因芯片技術檢測大鼠腦皮質中miRNAs表達譜的變化，發現包括 miR－27a、－32、－129、153等在內的9個 miRNAs表 達 上 調，而 包 括 miR－20a、－23b、－190、－191、－195、－320等在內的27個miRNAs表達下調［32］。

全世界人口缺血性腦卒中的發病率正在迅速上升，而目前對于該病的診斷僅限于臨床癥狀及影像學檢查，miRNA的發現為理解缺血性腦卒中的基因調控提供了全新視角。miRNA廣泛參與缺血性腦卒中的發生、發展過程，如動脈粥樣硬化、腦水腫、缺血再灌注損傷等方面。目前已有較多研究證明血清及血漿中均存在著穩定的miRNA［33－34］，也有研究證實，在腦缺血24h后的大鼠血漿中檢測出腦組織特異性高表達的miR－124a表達明顯增高［35］，故有可能通過對miRNA的進一步研究，使其成為缺血性腦卒中的血液標志物，協助早期診斷并有可能評估預后。Liu等［36］研究發現在大鼠局灶性腦缺血7d后，腦室管膜下區神經祖細胞中miR－124a的表達顯著下降，而將 miR－24amimics（mir－124a的生物模擬物）導入缺血后的腦室管膜下區神經祖細胞中，可抑制腦缺血后神經祖細胞的增殖，促進神經細胞的分化，達到腦保護作用。故研究缺血性腦卒中的相關特異性miRNA，可能使其成為藥物靶標，或模擬這一分子進行新藥研發，可能會給人類缺血性腦卒中的治療帶來新的希望。然而，由于miRNA的數量龐大，每個miRNA的靶基因是什么，具體發揮怎樣的功能，miRNA與靶基因mRNA錯綜復雜的交聯關系，不同miRNA的組織特異性、時限性，以及相同miRNA在動物及人類中的表達差異性等一系列問題尚需要大量的研究與探討，要想把miRNA分子充分用于人類疾病的診斷和治療，目前的研究工作還只是冰山一角。

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