鵝細小病毒PCR－DHPLC檢測方法的建立

饒桂波，邵洪澤，胡桂學＊，吳健敏

（1.廣西獸醫研究所，廣西南寧530001；2.吉林省獸醫科學研究所，吉林長春130062；3.吉林農業大學，吉林長春130118）

目前診斷鵝細小病毒（GPV）的主要方法有瓊脂擴散試驗、免疫熒光抗體試驗、黃牛精子抑制試驗、ELISA 和PCR 等［1－4］。近年來將變性高效液相色譜法（DHPLC）與PCR 方法結合用于微生物的檢測，使PCR 方法的敏感度提高了100倍，大大提高了樣品的檢出率［5－6］。為了解決鵝群中因GPV 排毒量低而難以檢出的問題，本研究擬建立一種敏感性更高的GPV PCR－DHPLC 檢測方法，用于鵝群中GPV 的檢測，為臨床GPV 感染的檢測，提供一種特異、敏感、快速、高通量的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 毒株

GPV JLDA 株，由吉林省畜牧獸醫科學研究院贈送；GPV JLTP株，由本實驗室分離保存。

1.2 試劑

Taq DNA Polymerase、dNTPs、100 bp DNA Ladder、T4DNA 連接試劑盒、pMD18－T 載體等，購自寶生物工程有限公司（大連）。

1.3 引物設計

根據GenBank中VP3 的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，序列如下：P1：5＇－ATA AGCGCC TTTCACAGC－3＇，P2：5＇－AACGCAGGATCAGACGAA－3＇，由寶生物工程有限公司（大連）合成。

1.4 PCR 體系建立

采用50μL 反應體系，在0.5 mL 反應管中依次加Buffer 5μL、2.5mmol／L dNTPs 2μL、滅菌二餾水35μL、2U／μL Taq酶1μL、20pmol／μL上游引物、下游引物各1μL、模板5μL。混勻后稍離心，通過梯度PCR 確定反應條件。

1.5 DHPLC條件選擇

根據變性高效液相色譜儀Aglient 1100 色譜柱：PS.DVB＆C18DNASep色譜柱（4.6mm ×50 mm，粒度3mm）。利用儀器軟件，根據目的基因序列的大小，堿基比率等預測柱溫。在柱溫確定后，摸索流動液體配比及流速，確定最佳條件。

1.6 PCR－DHPLC特異性分析

提取鵝副粘病毒、鴨瘟病毒及正常番鴨胚尿囊液的核酸進行PCR，按照1.4 的體系條件對PCR產物，進行PCR－DHPLC檢測，鑒定其特異性。

1.7 PCR－DHPLC敏感性分析

將GPV JLTP株病毒接種番鴨胚，提取尿囊液中的病毒核酸作為模板，利用上述引物擴增目的片段，擴增產物連接到pMD18－T 載體上克隆。……