干旱脅迫下長豇豆莖干持綠性的關聯分析

魯忠富,胡耀文,汪寶根,吳曉花,徐 沛,李國景

（浙江省農業科學院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

干旱脅迫下長豇豆莖干持綠性的關聯分析

魯忠富,胡耀文,汪寶根,吳曉花,徐 沛,李國景

（浙江省農業科學院蔬菜研究所,浙江杭州 310021）

利用已建立的快速、準確的長豇豆種質苗期耐旱性鑒定技術體系鑒定了我國99份長豇豆微核心種質的重要耐旱性指標莖干持綠性。利用覆蓋全基因組的1127個SNP標記進行核心種質群體的基因型分析和表型-標記關聯分析,獲得與莖干持綠性顯著相關的SNP標記4個（P＜10-4）。

長豇豆；耐旱；莖干持綠性；SNP；關聯分析

豇豆［Vignaunguiculata（L.）Walp］起源于非洲,是重要的豆類作物。長豇豆（V. sesquipedalis）是豇豆的一個重要亞種,廣泛種植于東南亞與中國各地。目前我國長豇豆年栽培面積在20萬hm2以上,主要于夏秋季種植,以采摘嫩莢作為菜用。由于種植季節正值高溫,干旱成為制約長豇豆生產的重要因素,嚴重影響長豇豆的產量和品質。挖掘、應用長豇豆耐旱基因是解決這一問題的重要手段［1］。

莖干持綠性（Stg）是指植物在遇干旱脅迫時能夠在一定時期內保持其莖干葉綠素不被破壞,維持細胞正常生命功能的性狀。該性狀已被證明可作為豇豆、高粱、大麥等作物重要的耐旱性指標,并且具有測定簡便、準確等優點［2］。關聯分析是利用不同基因座等位變異（基因）間的連鎖不平衡關系進行標記與性狀的相關性分析的遺傳學方法,以達到鑒定控制特定性狀基因（或染色體區段）的目的［3］。連鎖不平衡是指群體內不同基因座基因間的非隨機性關聯。關聯分析已被廣泛用于動植物重要性狀基因的挖掘、鑒定工作［4］。本研究即利用基于SNP標記的關聯分析開展豇豆耐旱性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

以我國長豇豆微核心種質群體中的99份種質為研究材料。

1.2 處理設計

種質材料直播于盆缽中,在玻璃溫室中栽培。基質為營養土和蛭石（1∶1）的混合物。實驗設置正常對照組2個重復,干旱處理組3個重復。各盆缽中均用量器量取等量基質裝填,播種時各播5粒種子,待第1對真葉平展后留取2株健壯一致的幼苗。脅迫處理前每盆缽每次均用等量且過量的水澆透基質。干旱處理組播種后18d停止澆水進行脅迫處理,在脅迫后第24d進行莖干持綠性表型觀察。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 基因型測定

DNA提取。取各材料葉片組織0.1g加液氮研磨成粉末,用Qiagene試劑盒參照說明書提取DNA。

基因型測定。用Kaspar豇豆DNA高通量SNP基因分型平臺進行基因型分析,具體方法參考文獻［5］。

1.3.2 莖干持綠性鑒定

將Stg分成0-5級：0級,莖干正常,無失綠；1級,≤20%莖干失綠；2級,20%～40%莖干失綠；3級,40%～60%莖干失綠；4級, 60%～80%莖干失綠；5級：＞80%莖干失綠至完全枯黃［6］。

1.4 關聯分析

關聯分析采利用Tassel2.1軟件進行,在混合線性模型（MLM）下進行運算。所用群體的群體結構和親緣關系系數采用文獻［5］的數據。

2 結果與分析

對正常對照和干旱處理條件下豇豆微核心種質群體的Stg調查結果（圖1）顯示,對照組沒有特征性的統計分布趨勢,其Stg變異主要由品種的葉綠素含量高低造成。而干旱處理組則呈現偏向低值的近正態分布的特點,表明干旱脅迫處理對多數植株造成了較重的脅迫,并且群體的Stg分布規律明顯,適宜進行關聯作圖分析。表1列出了對照和處理組豇豆微核心種質群體莖干持綠性描述統計值。

圖1 正常對照和干旱處理下豇豆微核心種質群體的Stg值頻率分布

表1 正常對照和干旱處理下豇豆微核心種質群體莖干持綠性描述結果

利用由高通量IlluminaGoldenGateSNP基因型檢測平臺轉化而來的KsaparSNP基因型檢測平臺高通量檢測了99份材料1127個SNP位點的基因型。結果表明,有1102個SNP成功檢測到信號,技術成功率為97.7%。1102個SNP中,有8個SNP在群體中缺失信號超過20%,5個SNP在10%以上的材料中為雜合基因型,247個SNP在群體中無多態,420個SNP的次要等位位點頻率值＜0.1。在去除上述低質量或低信息量SNP位點后,有422個SNP位點的基因型數據被用于連鎖不平衡分析。SNPs在群體中呈雙等位位點和連續頻率分布,頻率分布峰值在0.1～0.18。

采用Tassel軟件的MLM關聯分析表明,以Stg為指標能在處理組中檢測到4個顯著性位點（P= 10-4）,但在對照組不能檢測到顯著性位點。顯著性位點及其P值見表2。

根據文獻［7］,這4個標記中1-1162位點定位于LG3上,其他3個標記位點定位到了普通豇豆整合遺傳圖譜上［8］,其中1-1481和1-1021位點均定位于LG2上且緊密連鎖,1-1286位點定位于LG10上。

表2 利用MLM關聯分析獲得的顯著性位點（P＜10-4）

3 小結和討論

本研究利用MLM方法檢測到了4個與豇豆莖干持綠性關聯的SNP位點,這些位點將作為潛在的分子標記位點用于今后的輔助育種。當前的工作正考慮利用傳統QTL定位方法分析這些顯著性位點與耐旱性相關QTL是否存在共定位關系。另外,由于SNP標記在實際育種中不如PCR標記簡便,后續工作將考慮將SNP標記轉化為PCR標記［9］。轉化成功后利用轉化的PCR標記只需通過檢測豇豆材料的基因組內是否存在與控制莖干持綠性的耐熱/旱基因顯著關聯的特異DNA片段,即可在苗期輔助快速確定該材料是否具對干旱脅迫的耐受性。

在普通豇豆耐旱性研究中,除莖干持綠性外,單葉和第1三出復葉衰老、植株萎蔫程度、三出復葉相對含水量、葉片最大光化學效率等指標也已被用于耐旱性研究。后續工作中將繼續開展上述指標與長豇豆耐旱性的關系研究,以期獲得更多與耐旱性關聯更緊密的標記位點。

［1］ 汪寶根,劉永華,吳曉花,等.干旱脅迫下長豇豆葉綠素熒光參數與品種耐旱性的關系［J］.浙江農業學報, 2009,21（3）：246-249.

［2］ MucheroW,EhlersJD,RobertsPA.Restrictionsite polymorphism-basedcandidategenemappingforseedlingdrought toleranceincowpea［Vignaunguiculata（L.）.Walp.］［J］. TheorApplGenet,2010,120（3）：509-518.

［3］ ShuX,BackesG,RasmussenSK.Genome-wideassociationstudy ofresistantstarch（RS）phenotypesinabarleyvarietycollection［J］.JAgricFoodChem,2012,60（41）：10302-10311.

［4］ MucheroW,RobertsPA,DiopNN,etal.Geneticarchitectureof delayedsenescence,biomass,andgrainyieldunderdroughtstress incowpea［J］.PLoSOne,2013,8（7）：e70041.

［5］ XuP,WuX,WangB,etal.Genomewidelinkage disequilibriuminChineseasparagusbean（Vigna.unguiculata ssp.sesquipedialis）germplasm：implicationsfordomestication historyandgenomewideassociationstudies［J］.Heredity, 2012,109（1）：34-40.

［6］ MucheroW,EhlersJD,CloseTJ,etal.MappingQTLfor droughtstress-inducedprematuresenescenceandmaturityin cowpea［Vignaunguiculata（L.）Walp.］［J］.TheorAppl Genet,2009,118（5）：849-863.

［7］ XuP,WuX,WangB,etal.ASNPandSSRbasedgenetic mapofasparagusbean（Vigna.unguiculatassp.sesquipedialis）andcomparisonwiththebroaderspecies［J］.PLoSOne, 2011,6（1）：15952.

［8］ MucheroW,DiopNN,BhatPR,etal.Aconsensusgenetic mapofcowpea［Vignaunguiculata（L）Walp.］andsynteny basedonEST-derivedSNPs［J］.ProcNatlAcadSci,2009, 106（43）：18159-18164.

［9］ LiG,LiuY,EhlersJD,etal.IdentificationofanAFLP fragmentlinkedtorustresistanceinasparagusbeanandits conversiontoaSCARmarker［J］.HortScience,2007,42：1153-1156.

（責任編輯：張才德）

S643.4

A

0528-9017（2014）02-0202-02

文獻著錄格式：魯忠富,胡耀文,汪寶根,等.干旱脅迫下長豇豆莖干持綠性的關聯分析［J］.浙江農業科學,2014（2）：202-203,207

2013-12-18

國家自然科學基金項目（30900985）

魯忠富（1963-）,男,浙江杭州人,實驗師,從事蔬菜育種及新品種推廣工作。E-mail：lzf0522@163.com。

李國景。E-mail：Guojing-li@yahoo.com.cn。