改良愈瘍方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠抗炎作用機(jī)制的研究

賈慧玲 朱葉珊 韓玉娜 雷淼娜 閆寶環(huán)

改良愈瘍方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠抗炎作用機(jī)制的研究

賈慧玲 朱葉珊 韓玉娜 雷淼娜 閆寶環(huán)

目的探討改良愈瘍方對(duì)右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠抗炎作用機(jī)制。方法40只雄性C57BL/6小鼠除正常組外，采用口服DSS造模后，按完全隨機(jī)法分為模型組、治療組、對(duì)照組，每組10只;正常組和模型組均用0.9%氯化鈉溶液灌腸，治療組動(dòng)物給與中藥灌腸，對(duì)照組給與柳氮磺胺吡啶灌腸共14 d。進(jìn)行結(jié)腸腫瘤壞死因子(TNF)-α水平測(cè)定及通過免疫組化檢測(cè)TNF-α在結(jié)腸組織中的表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組、治療組治療前與模型組基本相同，治療后治療組的大便較成形、血便及體質(zhì)量減輕較不明顯，一般情況優(yōu)于模型組及對(duì)照組(P＜0.05)。SS小鼠結(jié)腸炎結(jié)腸組織中TNF-α較正常組顯著增高(P＜0.05)，用中藥治療組則顯著降低，且優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。同時(shí)，在模型組小鼠結(jié)腸組織中，TNF-α表達(dá)主要見于黏膜和黏膜下層，主要集中在靠近糜爛或潰瘍的周邊，小血管擴(kuò)張的周圍，也相對(duì)增多，治療組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，與模型組及對(duì)照組比較均有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論改良愈瘍方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠具有良好的治療作用，其作用機(jī)制是通過降低TNF-α含量，抑制炎癥有關(guān)。

潰瘍性結(jié)腸炎;中藥灌腸;動(dòng)物模型;促炎因子

潰瘍性結(jié)腸炎是病因尚未完全明確的結(jié)腸黏膜慢性炎癥損傷性腸病，好發(fā)于乙狀結(jié)腸和直腸，其病情反復(fù)，病程遷延。目前除外爆發(fā)型或病情嚴(yán)重需手術(shù)治療的患者，一般患者多采用內(nèi)科治療，該病常用藥物為柳氮磺胺吡啶水楊酸制劑(如艾迪莎、美沙拉嗪等)、皮質(zhì)類固醇激素(如強(qiáng)的松、地塞米松等)和免疫抑制劑，其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的緩解率約80%，最佳維持緩解方案也僅能使復(fù)發(fā)率降低50%左右，常因這些藥物的不良反應(yīng)使維持受阻［1］。中藥復(fù)方改良愈瘍方具有解毒消癰，燥濕泄?jié)岬墓πВ緦?shí)驗(yàn)應(yīng)用更接近人潰瘍性結(jié)腸炎免疫學(xué)特點(diǎn)的右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的模型小鼠，通過改良愈瘍方灌腸治療，以觀察其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的治療作用并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性C57BL/6小鼠(體重18～22 g;7～12周)(北京維通利華有限公司)，合格證號(hào):SCXK(京)2011-0009;DSS(Sigma公司);腫瘤壞死因子(TNF)-α多克隆抗體(Santacrus公司，美國(guó))。

1.2 分組與模型 將小鼠按隨機(jī)數(shù)隨機(jī)分入正常組、模型組、治療組和對(duì)照組，每組10只;右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)，分子量 36 000～50 000，10 g DSS粉溶于500 ml自來水中，配成2%濃度，放入4℃冰箱保存。正常組小鼠自由飲用蒸餾水;其余3組自由飲用2%DSS 7 d。

1.3 藥物 改良愈瘍方為中藥復(fù)方(白頭翁15 g，穿山龍12 g，敗醬草12 g，徐長(zhǎng)卿9 g，仙鶴草15 g，地榆15 g，檳榔9 g，薏苡仁15 g)，原液每毫升含生藥3.0 g，由唐山市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。1 ml/d灌腸。柳氮磺胺吡啶(上海三維制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格:250 mg/片，批號(hào):200609C15)。將片劑用研缽研細(xì)，用100目篩篩過，用蒸餾水配成懸濁液，按0.30 g/kg給藥，1 ml/d灌腸。模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌腸;治療組給予中藥灌腸;對(duì)照組給予柳氮磺胺吡啶灌腸;14 d為1個(gè)療程。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 觀察造模期間動(dòng)物的一般情況:包括體質(zhì)量變化分?jǐn)?shù)、大便性狀分?jǐn)?shù)、便潛血分?jǐn)?shù)。各組動(dòng)物從給藥到第15天每天記錄動(dòng)物的一般情況，大便性狀、用鄰聯(lián)甲苯胺法測(cè)便潛血，早晚各1次，并計(jì)算大鼠體質(zhì)量下降百分率。采用夏劍等［2］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)并作改進(jìn)，體質(zhì)量下降記正分，體質(zhì)量增加記負(fù)分，便潛血按陽(yáng)性強(qiáng)度分別記0～5分。

1.4.2 檢測(cè)方法:用2%烏巴比妥鈉對(duì)小鼠腹腔麻醉(3 ml/kg)后取下整段結(jié)腸，于距肛門6 cm處選取0.5 cm長(zhǎng)的結(jié)腸，縱向切開，用液氮冷凍后切片，厚度為5 μm，用作TNF-α免疫組化，余結(jié)腸稱重后置入－80℃冰箱保存作ELISA組織測(cè)定用，具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作。

1.4.3 結(jié)果判斷:細(xì)胞呈棕黃色為陽(yáng)性，觀察結(jié)腸組織各層陽(yáng)性細(xì)胞分布特征，每張切片選取5個(gè)最高陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域，在高倍鏡下(1×400)記數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，求其平均值作為該片陽(yáng)性細(xì)胞均值［3］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 實(shí)驗(yàn)期間，正常組小鼠反應(yīng)靈活，毛色光潤(rùn)，喜活動(dòng)，主動(dòng)覓食，大小便正常;模型組第2天開始精神萎靡，懶于活動(dòng)，被毛松散無(wú)澤，拱背，食量下降，拉稀便或黏液血便，形態(tài)消瘦，體重下降，活動(dòng)進(jìn)食減少。對(duì)照組、治療組治療前與模型組基本相同，治療后治療組的大便較成形、血便及體重減輕較不明顯，一般情況優(yōu)于模型組及正常組。4組疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)情況見表1。

表1 4組DAI積分比較n=10，±s

表1 4組DAI積分比較n=10，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與對(duì)照組比較，#P ＜0.05

DAI治療組 1.23 ±0.15*#組別0.32 ±0.13對(duì)照組 1.16 ±0.29*模型組 3.07 ±0.41正常組

2.2 光鏡下大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài) 正常組大鼠結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮細(xì)胞排列整齊;腸腺規(guī)則，杯狀細(xì)胞豐富，間質(zhì)未見充血水腫，固有層可見毛細(xì)血管。模型組可見黏膜層大片缺失，黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可見水腫、壞死的黏膜脫落而形成的潰瘍?cè)睿⒖梢娝[、出血和急性血管炎，血管壁呈纖維素樣壞死。治療組為間質(zhì)充血水腫不明顯，散見少量炎性細(xì)胞。其基本形態(tài)與正常組相似。黏膜上皮及腺管排列整齊，杯狀細(xì)胞豐富。對(duì)照組為潰瘍較淺表，潰瘍旁上皮修復(fù)明顯，腺體增生活躍;隱窩、腸腺及間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1～4。

圖1 正常組結(jié)腸黏膜組織形態(tài)(SP×200)

圖2 模型組結(jié)腸黏膜組織形態(tài)(SP×200)

圖3 對(duì)照組結(jié)腸黏膜組織形態(tài)(SP×200)

圖4 治療組結(jié)腸黏膜組織形態(tài)(SP×200)

2.3 結(jié)腸組織TNF-α水平測(cè)定的結(jié)果 DSS小鼠結(jié)腸炎結(jié)腸組織中TNF-α較正常組顯著增高，用治療組則顯著降低，且優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)，在模型組小鼠結(jié)腸組織中，TNF-α表達(dá)主要見于黏膜和黏膜下層，主要集中在靠近糜爛或潰瘍的周邊，小血管擴(kuò)張的周圍，也相對(duì)增多，治療組TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，與模型組及對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 結(jié)腸組織TNF-α水平比較及表達(dá)n=10，±s

表2 結(jié)腸組織TNF-α水平比較及表達(dá)n=10，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.01;與對(duì)照組比較，#P ＜0.05

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)治療組 9.80 ±2.43*# 22.18 ±9.01*#組別 TNF-α(pg/mg 蛋白) TNF-α 6.31 ±2.72 18.37 ±13.82對(duì)照組 12.48 ±0.21 33.36 ±15.46模型組 14.62 ±3.96* 38.24 ±10.47*正常組

3 討論

TNF-α又稱惡液素或分化誘導(dǎo)因子(DIF)，是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種肽類物質(zhì)，主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的胞漿中，可使中性粒細(xì)胞聚集，產(chǎn)生脫顆粒，對(duì)淋巴細(xì)胞有刺激作用，可上調(diào)趨化因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)的表達(dá)［4］。腫瘤壞死因子不但對(duì)人或動(dòng)物多種腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，而且還對(duì)機(jī)體炎癥與免疫反應(yīng)起到重要的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)表明，通過改良愈瘍湯為中藥復(fù)方治療的DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠，大便較成形、血便及體質(zhì)量減輕較不明顯，表明該方法對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠具有很好的治療作用。本實(shí)驗(yàn)還表明:潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織中TNF-α較正常組顯著增高，用改良愈瘍湯治療后則顯著降低，說明改良愈瘍湯通過對(duì)TNF-α的抑制作用，減輕促炎細(xì)胞對(duì)結(jié)腸的損害，從而起到抗炎作用。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)表明通過應(yīng)用改良愈瘍湯治療的DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠腸組織中，TNF-α陽(yáng)性表達(dá)數(shù)明顯減少，可見抑制TNF-α可以減少其對(duì)黏膜的損傷。

潰瘍性結(jié)腸炎屬于中醫(yī)“泄瀉”、“痢疾”、“腸癖”等范疇。中醫(yī)學(xué)在潰瘍性結(jié)腸炎的研究方面，已形成了獨(dú)特的理論體系，已經(jīng)非常規(guī)范并取得了重大突破，受到了國(guó)內(nèi)外的重視和國(guó)人的青睞。本方中白頭翁、敗醬草為治痢名藥，具有清熱解毒，涼血止痢的功效，尚能宣通胃腸郁火，時(shí)熱毒能散能清，善于清腸濕熱及血分熱毒，合為君藥，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)白頭翁具有抗病原微生物，緩解胃腸平滑肌肌痙攣，止血收斂等作用;仙鶴草、地榆涼血止血，穿山龍、徐長(zhǎng)卿祛風(fēng)化濕，解痙止痛作用，共為臣藥，現(xiàn)代藥理研究顯示，穿山龍、徐長(zhǎng)卿可以抗炎止痛，調(diào)節(jié)免疫，具有類激素作用［5，6］;薏苡仁補(bǔ)脾除濕，同時(shí)也防止苦寒之品克伐脾胃，為佐藥，其所含薏苡仁油對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫有促進(jìn)作用，同時(shí)具有抗炎作用;檳榔苦泄辛散，善行氣止痛、實(shí)腸止瀉，取行氣則后重自除之意，為使藥［7－9］。

綜上所述，改良愈瘍方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠具有良好的治療作用，本方配伍規(guī)整，用藥簡(jiǎn)潔，既符合傳統(tǒng)中醫(yī)理論對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎大便膿血癥狀的病因病機(jī)的理解和治療方法，也通過動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示其作用機(jī)理與TNF-α具有抑制作用，為臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。此外，中藥保留灌腸可使藥物直達(dá)病所，直接作用于病變部位，是治療潰瘍性結(jié)腸炎較好的方法。

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Study on the mechanism of anti－inflammatory effect of improved Yuyangfang on mouse model with ulcerative colitis induced by dextran sulfate sodium

JIA Huiling*，ZHU Yeshan，HAN Yuna，et al.*Department of Anus－ Intestine Diseases，TCM Hospital of Leting County，Hebei，Laoting 063600，China

ObjectiveTo investigate the mechanism of anti－inflammatory effect of improved Yuyangfang on mouse model with ulcerative colitis(UC)induced by dextran sulfate sodium(DSS).MethodsForty male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups:normal control group，model group，treatment group，control group，with 10 mice in each group.Except for normal control group，the mice in control group，model group and treatment group were given orally 4%DSS to establish animal models with ulcerative colitis.After the models were successfully established，the mice in control group and model group were treated with saline enema，however，the mice in treatment group were treated with Chinese medicine enema，in addition，the mice in control group were treated with salazosulfapyridine enema for 14 days.The expression level TNF-α in colon tissue were detected by immunohistochemisty.ResultsAfter treatment the treatment group was superior to control group and model group in the aspects of stools forming，bloody stool，body weight lightening and general condition(P ＜0.05).The expression level TNF-α in colon tissue of model mice with UC were significantly higher than those in normal control group(P＜0.05)，however，which were obviously decreased in treatment group，moreover，treatment group was superior to control group(P ＜0.05).At the same time，the expression of TNF-α in mouse’s colon tissue of model group was mainly found in mucosa and submucosa tissue，mainly concentrated on the tissues of erosion，ulcer and small blood vessels dilatation，TNF-α positive cells in treatment group were significantly decreased，as compared with those in model group and control group(P ＜0.05).ConclusionThe improved Yuyangfang is effective in treating ulcerative colitis in model mice，and its action mechanism may be related to reducing TNF-α levels and inhibiting inflammation reaction.

ulcerative colitis;Chinese medicine enema;animal model;proinflammatory factor

R 574.62

A

1002－7386(2014)14－2088－03

10.3969/j.issn.1002 －7386.2014.14.002

項(xiàng)目來源:唐山市科技局指令性計(jì)劃(編號(hào):121302110b)

063600 河北省樂亭縣中醫(yī)院肛腸科(賈慧玲);河北省唐山市中醫(yī)醫(yī)院(朱葉珊、韓玉娜、雷淼娜);河北省胸科醫(yī)院(閆寶環(huán))

2013－12－22)