重組的脂聯素調節肝細胞系L02基質金屬蛋白酶- 9表達及活性

陶冬英， 王 云，倪晶晶，楊菊林，范任華

(1.寧波衛生職業技術學院 人體形態教研室， 浙江 寧波 315104； 2.寧波市第二醫院 外科， 浙江 寧波 315100；3.長沙市中心醫院 檢驗科， 湖南 長沙 410004)

肝纖維化是各種肝細胞毒性物質對肝臟慢性損傷所引起的肝臟病理改變，日前研究認為，肝星狀細胞(hepatic stellaate cell，HSC)激活是肝纖維化的中心環節[1]。 脂聯素(adiponectin)是一種脂肪組織特異性分泌的蛋白質，它具有促進血漿游離脂肪酸氧化、抗動脈粥樣硬化等多種生物學功能[2]。近來研究發現脂聯素具有一定的抗肝纖維化作用，但脂聯素抗纖維化機制還未完全闡明，本研究擬構建人全長脂聯素真核表達質粒，轉染L02肝細胞檢測其表達，旨在為進一步研究脂聯素在肝纖維化中的作用及機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

L02細胞(東南大學病理教研室饋贈)，pEGFP-C1(Clontech公司)，Trizol reagent、Adiponectin、MMP- 9、內參β-Actin 引物、RT-PCR試劑盒、限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ(Takara公司)，脂質體Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，明膠(Sigma公司)，復性液、孵育液均購自Bio-Rad公司，Anti-Adiponectin鼠抗人抗體(Abcam公司)，HRP標記山羊抗鼠二抗(中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1 構建重組載體和轉染肝細胞：以人脂肪細胞總mRNA為模板，用RT-PCR方法擴增adiponectin基因外顯子全長DNA片段,引物見表1。經過限制性內切酶消化基因adiponectin，酶消化的PCR產物插入pEGFP-C1獲得重組綠色熒光蛋白載體adi-pEGFP-C1質粒。重組載體經酶消化鑒定和基因測序驗證重組載體構建成功。重組載體轉化到大腸桿菌JMl09中擴增，裂解細菌抽提純化重組載體質粒。然后，重組質粒用脂質Lipofectamine2000穩定轉染的L02細胞, 熒光顯微鏡計數熒光分布均勻的細胞，數500個細胞得出其中有熒光的細胞155個，轉染效率為31%， 用300 μg/mL的G418的篩選，獲得穩定的adi-pEGFP-C1/L02細胞系。……