miR- 196a- 5p抑制小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新

趙華路，姚 南，魏雪菊，王蘭蘭，張俊武，黃 粵，余 佳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 國(guó)家醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)因其具有在體外可無(wú)限增殖并可分化為體內(nèi)任何種類細(xì)胞的潛能而被廣泛研究[1]。microRNA (miRNA)作為細(xì)胞內(nèi)一類重要的非編碼調(diào)控分子，許多miRNA已被證實(shí)參與了ESC及iPS細(xì)胞的產(chǎn)生和分化過(guò)程，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2- 6]。將ESC中miRNA產(chǎn)生和成熟的關(guān)鍵基因Dicer或DGCR8敲除后，ESC均表現(xiàn)出增殖能力不同程度的減弱，且均不能正常向3個(gè)胚層分化，而喪失其全能性[7- 8]。說(shuō)明miRNA在ESC的自我維持尤其是分化中具有非常關(guān)鍵的作用。且Dicer-/-和DGCR8-/-ESC因可以作為研究miRNA功能的有利工具[7]。

小鼠胚胎干細(xì)胞 (mouse embryonic stem cells，mESC) 早期分化的microRNA測(cè)序數(shù)據(jù)顯示miR- 196a- 5p在胚狀體(embryoid body, EB)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)上升[9]，但其在mESC中的具體功能及機(jī)制仍然未知。因此，本研究在DGCR8-/-mESC中重新引入了miR- 196a- 5p的表達(dá)，檢測(cè)了miR- 196a- 5p重新表達(dá)后對(duì)于mESC自我更新能力的影響，確定了miR- 196a- 5p在抑制mESC增殖及自我更新中的功能。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

野生型小鼠胚胎干細(xì)胞系V6.5及DGCR8-/-小鼠胚胎干細(xì)胞系ES1(北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所汪陽(yáng)明教授惠贈(zèng))，白血病抑制因子(LIF)(ESG1107，Millipore公司)，DharmaFECT1(Dharmacon公司)，miR- 196a- 5p mimics 及對(duì)照(Dharmacon公司)，堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(86R- 1KT，Sigma公司)，Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)，實(shí)時(shí)定量PCR所用試劑(Takara公司)。實(shí)驗(yàn)中所用抗體分別為：Oct4抗體(sc- 5279，Santa Cruz)，TRITC山羊抗鼠IgG(ZF- 0313，中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 mESC的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

mESC培養(yǎng)于M15培養(yǎng)基(15%胎牛血清，2 mmol/L GlutaMAX，0.1 mmol/L 非必需氨基酸，0.1 mmol/L β-巰基乙醇，1 000 U LIF)，經(jīng)0.1% Gelatin處理的細(xì)胞培養(yǎng)板中。

擬胚體(embryoid body，EB)形成實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的V6.5細(xì)胞以(1～1.5)×106細(xì)胞/10 cm培養(yǎng)皿的密度接種，使用10 cm Petri Dish培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基?！?br>