干擾素α通過P204和P21誘導大鼠原代血管平滑肌細胞凋亡

龍向淑，吳 強，宋 方，黃 晶，張林軍

(貴州省人民醫院 心血管內科， 貴州 貴陽 550002)

細胞凋亡、增殖及分化等均是維持生物體動態平衡必需的細胞活動。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖增多及凋亡減少是高血壓、動脈粥樣硬化及血管成形術后再狹窄等血管增殖性疾病的主要發病機制。干擾素(interferon，IFN)與相應受體結合，誘導一系列IFN刺激反應基因(IFN stimulated genes，ISGs)表達而發揮其抗病毒、免疫調節、抑制細胞增殖及促進細胞凋亡等作用[1- 3]。P204是IFN誘導蛋白P200家族的鼠類蛋白成員，研究顯示，IFN-α可誘導P204表達而抑制大鼠VSMCs及血管外膜成纖維細胞增殖[4- 6]，P21表達變化與P204呈一致性趨勢，提示P21可能參與P204對VSMCs增殖的調控[4]。研究發現，IFN可誘導腫瘤及病毒感染細胞凋亡[1- 2]，但IFN對VSMCs凋亡的影響及其機制尚未見文獻報道。本研究用IFN-α和/或P204 siRNA處理大鼠原代VSMCs，觀察VSMCs凋亡及P204和P21表達的變化，為IFN及ISGs在血管增殖性疾病領域的應用提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑(盒)

清潔級SD大鼠(雌性1只，雄性2只)，年齡約5周齡，體質量120 ～140 g[第三軍醫大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(渝)2012- 0003]。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)；DMEM高糖型細胞培養液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(均Hyclone公司)；α-SMA單克隆抗體(BM0002)、即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒(均武漢博士德公司)；四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](Sigma 公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1063)和Tubulin抗體(碧云天公司)；Trizol總RNA提取試劑(DP405)、2×Taq PCR MasterMix(KT201)和100 bp DNA Ladder(均北京天根公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR擴增引物由寶生物工程有限公司合成(大連)(表1)；P204抗體(Santa Cruz公司)；p21抗體(ab92675)(Abcam公司)。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

1.2 細胞培養及實驗分組

按文獻[7]的方法培養VSMCs。取4～6代細胞用于實驗。……