Shh促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2的成骨分化

李 麗，董 謙，馮巧靈，王玉鳳，何通川，羅進(jìn)勇

(重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有極強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，常作為種子細(xì)胞修復(fù)、重建受傷或發(fā)生病變的多種組織器官，目前在骨再生研究中應(yīng)用廣泛[1- 2]。

MSCs在定向成骨分化過(guò)程中受多種細(xì)胞因子調(diào)控，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)家族發(fā)揮了重要作用。BMPs屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transform growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一，目前已分離和鑒定出20余種，其中BMP2和BMP7已應(yīng)用于臨床[1,3]。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)：BMP2-BMP15中，BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的能力最強(qiáng)[3]。

Shh是由SHH (Sonic Hedgehog)編碼的一種分泌型糖蛋白，可與細(xì)胞膜上跨膜受體Patched結(jié)合活化另一跨膜受體Smoothened，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Gli轉(zhuǎn)錄因子的活性而激活SHH信號(hào)通路。有研究報(bào)道在脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)過(guò)程中BMP2和BMP4可與SHH共同調(diào)控骨骼的形成[4- 5]。然而對(duì)于Shh是否可以調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化的作用目前并不清楚。因此，本研究旨在觀(guān)察Shh對(duì)BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化的影響，并初步探討其可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

腺病毒Ad-Shh和Ad-RFP(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)，Ad-BMP9和p12SBE-luc(芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心何通川教授惠贈(zèng))；C3H10T1/2和HCT116 細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，ALP定量檢測(cè)試劑盒(BD公司)；Naphthol AS-MX 堿性磷酸酶溶液、Fast Blue RR Salt、茜素紅S、β-磷酸甘油和維生素C(Sigma公司)；Lipofectamin2000TM(Invitrogen公司)；熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Promega公司)；PCR引物(上海百力格公司)；一抗β-actin、OPN、OCN、Runx2、DLX5、BMP9和總Smad1/5/8(Santa Cruz公司)，一抗Phosphor-Smad1/5/8(Cell Signaling公司)；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：C3H10T1/2和HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清和100 mmol/L的青霉素以及100 g/L的鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。……