RNA干擾聯合阻斷MMS2和REV3基因表達 減輕結腸癌細胞系THC8307/L-OHP對奧沙利鉑的耐藥性

李元杰，張 蕾，隋 御，徐 方*

(寧夏醫科大學 1.基礎醫學院； 2.生育力保持教育部重點實驗室， 寧夏 銀川 750004)

化療在中晚期癌癥的治療及預防復發轉移中具有十分重要的地位，在臨床上，傳統的化療方案被普遍應用于不同種類的癌癥治療中，由于化療藥物缺乏特異性，因而導致臨床使用的藥物濃度相對較高，往往會對患者機體帶來極大的損傷，隨著化療過程的推進，多種藥物聯合使用，腫瘤細胞的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)也就隨之出現，繼而成為制約惡性腫瘤治療的最大的難題[1]。隨著現代醫學技術的發展，研究者們期望通過分子生物學手段靶向干預目的基因表達，以此來實現耐藥性逆轉。國內外研究顯示，跨損傷合成途徑(translesion DNA Synthesis, TLS)與細胞突變及腫瘤的發生發展密切相關[2]，同時與鉑類藥物耐藥的分子機制密切相關[3]。由此，本實驗選擇了TLS途徑的關鍵基因REV3和MMS2作為目的基因，運用 RNAi 技術下調目的基因在人高分化耐奧沙利鉑結腸癌細胞系(THC8307/L-OHP)中的表達，探討TLS與鉑類耐藥逆轉的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

人高分化結腸癌細胞系(THC8307)及人高分化耐奧沙利鉑結腸癌細胞系(THC8307/L-OHP)(天津醫科大學生命科學中心實驗室湯華教授建立并惠贈)，攜帶GFP(綠色熒光蛋白)的實驗組質粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-REV3, pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2及陰性質粒pcDNA6.2-GW/EmGFP(上海松正生物公司)；注射用奧沙利鉑(L-OHP，南京制藥廠)；LipofectamineTM2000(Invitrogene公司)；四甲基偶氮唑藍 (MTT)(Sigma公司)；REV3、MMS2基因引物(上海生工生物工程有限公司)；引物序列見表1；MMS2一抗(Abcam 公司)、REV3一抗(Santa Cruz Biotechnology)；MMS2二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)、REV3二抗(Jackson公司)；四甲基偶氮唑藍 (MTT)、Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒、DAPI染色試劑盒(均南京凱基生物科技發展有限公司)?！?br>