水中硝基苯胺類化合物酶免疫化學分析技術

唐文濤

摘要：在硝基苯胺類化合物的檢測過程中一般會采用高效液相色譜以及氣相色譜對其進行檢測，但是檢測周期較長，需要較大的經濟成本，不足以滿足快速鑒定診斷的需求。文章對水中硝基苯胺類化合物酶免疫化學分析技術進行了綜合性的闡述，通過相關實驗對該技術進行了探析，供大家參考。

關鍵詞：硝基苯胺類化合物；酶免疫化學；分析技術；液相色譜；氣相色譜

中圖分類號：X832 文獻標識碼：A 文章編號：1009-2374（2013）35-0049-02

硝基苯胺類化合物有著很大的毒性，能夠經皮膚以及呼吸道吸收。如果吸收量過大便會誘發產生高鐵血紅蛋白，從而使人體出現缺氧以及紫紺等癥狀，這對于整個神經系統會帶來較大的危害，如果中毒進一步加深將會直接威脅到生命安全。硝基苯胺類化合物還會誘發溶血性貧血。隨著我國農業、工業的不斷發展，硝基苯胺類化合物的使用范圍也越來越廣，在醫藥、農藥、工業染料等方面都有著十分廣泛的作用。因此硝基苯胺類化合物的檢測也被越來越重視。在傳統的檢測中主要是以色譜柱技術為主，包括了GC、HPLC、GC/MS以及HPLC/MS。相對而言色譜柱技術檢測時間較長、操作較為繁瑣同時需要較高的經濟成本，這就讓硝基苯胺類化合物檢測的效率受到了一定的影響。近年來隨著酶免疫化學分析技術的不斷成熟，酶聯免疫吸附受到了很大的關注，其應用領域也在不斷延伸。通過將硝基苯胺類化合物檢測與酶聯免疫吸附結合起來，可提高硝基苯胺類化合物檢測的精確度并達到縮短檢測時間的目的。

1 實驗器材、試劑以及動物

實驗試劑：戊二醛、4-硝基苯乙胺、牛血清白蛋白和卵清蛋白、兔血清、四甲基聯苯胺、羊抗兔IgG-HRP、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（試劑均為分析純）。

實驗器材：磁力攪拌、高速冷凍離心機、酶聯免疫檢測儀、紫外分光光度計、96孔酶標板。

實驗動物：雄性大白兔。

2 實驗步驟

2.1 合成完全抗原

圖1 4-硝基苯乙胺、BSA偶聯

將戊二醛以及BSA進行反應，保證戊二醛過量，讓酶分子僅與其中的一個醛基進行結合。反應以后用凝膠過濾層進行過濾，得到BSA-戊二醛復合物，再加入4-硝基苯乙胺進行偶聯，如圖1所示。包被抗原制備與上述方法一致，將BSA更替為OVA，并加入過量的賴氨酸讓過量醛基反應。

2.2 完全抗原性能鑒定

利用紫外分光光度計對硝基苯乙胺以及BSA偶聯進行相應的鑒定，在波長為200～400nm的紫外光照下測定相關的吸光值，并對其進行激光解吸附電離飛行時間質譜（需要紫外掃描計算基質輔助）來測定偶聯物中4-硝基苯乙胺與蛋白的摩爾比。在整個偶聯反應過程中會出現多聚物甚至是沉淀，所以在分析的過程中也需要對副反應程度進行分析。在此基礎上采用SDS-PAGE凝膠電泳對硝基苯乙胺完全抗原的構成進行測定。

2.3 抗體制備

采集免疫血清之前雄性大白兔的血樣作為對照，以PBS對免疫原復合物（4-硝基苯乙胺-BSA）進行稀釋，得到梯度濃度（100ug/只、150ug/只、200ug/只），然后再給予注射。在第一次注射的過程中，將等體積完全福氏佐劑加入到4-硝基苯乙胺之中（1mL）以達到乳化效果，之后再進行注射，隔周以后加強免疫注射，共加強三次，若最后得到的抗血能夠超過1∶1×104就可以提取使用。需要注意的是，在進行血液采集之前應該先讓雄性大白兔禁食，避免血脂過高。采集血液之后靜置1小時，之后對血液凝集進行離心，分離出血清，裝管。離心溫度為4℃，轉速為5000～7000r/min，時間控制在10～15min。

2.4 抗體純化

經過離心得到的抗血清以辛酸-硫酸銨進行純化，再通過電泳法來測定多克隆抗體分子量區間。

2.5 酶聯免疫吸附操作流程

主要步驟為包被抗原→洗滌→添加封閉液→添加檢測血清→添加羊抗兔IgG→添加入四甲基聯苯胺溶液→添加終止液。

2.6 效價評定

對抗血清與對照血清進行逐級稀釋，對照血清中加入100uLPBS，并以酶聯免疫吸附方法來測定相關效價，多次測定后以最大稀釋倍數作為最終效價。

2.7 構建ic ELISA方法

將4-硝基苯乙胺-OVA在緩沖液當中稀釋，濃度為0.5ng/L。將稀釋之后的4-硝基苯乙胺-OVA加入到酶標板上（每孔50uL），在密封之后除去包被抗原，并進行洗滌。添加封閉液溫育，加入梯度4-硝基苯乙胺以及抗體，抗體量為60uL，再次進行溫育（溫度控制在37℃，時間為1小時），將抗血清除去并進行洗滌。之后加入了酶標二抗工作液（每孔100uL），溫育1小時，溫度為37℃。以Logistic模型來確定檢測范圍。

2.8 特異性檢測

采用以下公式來測定交叉反應率：

交叉反應率=4-硝基苯乙胺抑制率50%時所需的濃度/結構類似物50%時所需的濃度×100%

結構類似物包括了鄰硝基苯胺、間硝基苯胺、對硝基苯胺、甲苯、苯胺。

3 結果評測

圖2 4-硝基苯乙胺棋盤實驗

采用以下公式對半抗原與載體的結合比進行計算：摩爾消光系數（ε）=吸光值/摩爾濃度；結合比=[ε280（偶聯物）-ε280（載體蛋白）]/ε280（半抗原）；另外還可以通過飛行時間質譜來進行結合比的計算：結合比=（完全抗原分子量-載體蛋白分子量）/半抗原分子量。

上述公式中ε280為完全抗原和載體蛋白在280nm的紫外吸收值的變化及半抗原在該波長處的摩爾消光系數。通過多克隆抗體純化效果鑒定以及多克隆抗體效價測定來分析得到相關的血清效價檢測結果，具體如下：

通過方陣實驗來確定酶聯免疫吸附方法的工作條件，首先應該將反應控制在靈敏區域，也就是說抗原出現變化時，吸光值將會呈現出相應的變化。將反應控制在抗原濃度較小的區域，從而達到節約試劑的效果，并且也可以從一定程度上降低特異性吸附作用。通過處理得到以下

曲線：

圖3 4-硝基苯乙胺間接競爭ELISA標準曲線

4 結語

在整個實驗過程中其核心是建立相關的酶聯免疫吸附方法，并以該方法為基礎對硝基苯胺類化合物進行測定。此方法操作較為簡便并且周期較短，重復性以及靈敏性都處于較高的水平。其整體穩定性相對來說要優于色譜法，在水環境下可以對硝基苯胺類化合物進行較為迅捷的

檢測。

參考文獻

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