11個攜帶線粒體tRNASer(UCN) G7444A突變的中國漢族非綜合征型耳聾家系分析評估

唐霄雯，陽婭玲，高應龍，肖紅利，何哲耘，鄭靜，3，鄭斌嬌，呂建新，金龍金，管敏鑫，3

（1.溫州醫科大學 Attardi線粒體生物醫學研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學 仁濟學院，浙江 溫州 325035；3.浙江大學 遺傳研究所，浙江 杭州 310058）

耳聾是人類感覺系統障礙最常見的疾病之一。50%以上的耳聾是由遺傳因素造成的，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X-連鎖以及母系遺傳等[1-2]。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變是母系遺傳性耳聾重要的分子遺傳基礎。目前與氨基糖甙類（aminoglycoside antibiotics，AmAn）藥物性耳聾和非綜合征型耳聾密切相關的mtDNA突變主要集中在線粒體12S rRNA和tRNASer(UCN)基因上[3-5]。其中位于線粒體12S rRNA上的A1555G和C1494T突變分別導致新的G-C和A-U堿基配對的形成，在線粒體12S rRNA上形成一個與AmAn結合的位點，使該類藥物更容易結合到線粒體12S rRNA上，從而導致耳聾的發生[6-7]。而位于線粒體tRNASer(UCN)基因上的A7445G、A7445C、G7444A、7472insC、T7510C和T7511C突變在功能上已經被證明與非綜合征型耳聾發病相關[8-13]。本研究將對已收集的以及新發現的11個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的中國漢族母系遺傳非綜合征型耳聾家系從臨床、家系和分子遺傳學等角度進行詳細的評估和分析。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2003年4月-2013年12月本課題組收集的中國漢族非綜合征型耳聾患者樣本2 650例。所有患者的臨床資料以及外周血樣采集均依據溫州醫科大學倫理委員會管理規定執行。經溫州、寧波地區4家醫院耳鼻咽喉頭頸外科門診進行詳細的發病史調查和體格檢查，確定患者是否具有其他臨床疾病表型，是否有AmAn使用史，以及是否有噪聲接觸史等其他致聾因素。

1.2 聽力學檢查 聽力學檢查主要包括純音測聽（pure tone audiometry，PTA）、聽覺腦干反應（auditory brainstem response，ABR）、聲阻抗以及畸變產物耳聲發射（distortion product otoacoustic，DPOAE）。以聽力水平的分貝（dB）值為單位記錄PTA結果，并以頻率500、1 000、2 000、4 000和8 000 Hz的聽閾平均值計算，根據標準對患者聽力損失程度進行分類，分5級：正常≤25 dB，輕度聾=26～40 dB，中度聾=4l～70 dB，重度聾=71～90 dB和極重度聾＞90 dB。PTA的聽力曲線類型分為斜坡型（slope）：聽力損失主要以2 000～8 000 Hz為主，患者聽力閾值水平隨測試頻率的升高而逐漸升高；平坦型（flat）：也稱全頻聽力下降型曲線，患者各聲音頻率的聽力水平基本一致；上升型（rising）：患者的低頻聽力250～1 000 Hz較差，隨測試頻率的升高聽力閾值逐漸降低；谷型（valley）：聽力損失以500～2 000 Hz為主；切跡型（notched）：僅單一頻率處閾值明顯升高，相鄰頻率正常或接近于正常；山型（ridge）：中間頻率閾值比兩端至少低20 dB。

1.3 耳聾相關熱點基因突變檢測

1.3.1 全基因組DNA提取：首先抽取耳聾患者外周靜脈血2～3 mL（EDTA抗凝），使用DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0）提取全基因組DNA，-20 ℃保存。嬰幼兒可采用三菱針針刺患兒耳垂、足底或手指，濾紙吸取2～3滴靜脈血后使用酚氯仿手工法提取全基因組DNA[14]，-20 ℃保存。

1.3.2 耳聾相關熱點基因突變檢測：以提取的全基因組DNA為模板，PCR擴增耳聾患者的線粒體12S rRNA、tRNASer(UCN)基因以及GJB2基因編碼區[15-16]，相應PCR擴增信息及測序峰圖如表1和圖1所示。

PCR產物經純化后送華大基因測序公司進行雙向測序，測序結果與校正的劍橋標準序列進行比對[17]，以確定是否含有耳聾相關熱點基因突變。

2 結果

2.1 先證者臨床資料分析 新發現的4個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變家系如圖2所示。NB133家系，先證者（II-3），男，24歲，2歲時因感冒靜脈注射AmAn抗感染1 d，1個月后發現雙側聽力下降，用藥前說話正常。先證者的兩個哥哥均表現為中度耳聾，大哥（II-4），42歲，有慶大霉素、新霉素用藥史，右耳聽閾55 dB，左耳聽閾53 dB；二哥（II-6），39歲，右耳聽閾52 dB，左耳聽閾62 dB，聽力曲線均為斜坡型。家系其他成員無AmAn用藥史且聽力正常。NB148家系，先證者（III-2），男，19歲，先天性耳聾，7～8個月時有用藥史（具體用藥不詳)，用藥后逐漸出現聽力下降。先證者弟弟（III-1），男，16歲，1個月時發現聽力損失，右耳聽閾113 dB，左耳聽閾110 dB，聽力曲線為斜坡型。家系其他成員聽力正常。WLT024家系，先證者（III-2），女，13歲，無明確用藥史，1歲時發現聽力不好，測聽發現極重度聽力下降。右耳聽閾110 dB，左耳聽閾115 dB，聽力曲線為平坦型。先證者表弟（III-10），男，7歲，先天性耳聾。WLT122家系，先證者（III-1），女，4歲，出生時對聲音有反應，2歲時無誘因出現聽力下降，否認AmAn用藥史。右耳聽閾108 dB，左耳聽閾106 dB。先證者表弟（III-3）先天性耳聾，其母親懷孕7個月時白帶檢驗支原體陽性，醫生曾告誡孩子出生后可能為聾啞兒。其他7個家系先證者及母系成員詳細臨床資料見楊愛芬等[18]和Jin等[19]報道。

表1 線粒體12S rRNA、tRNASer(UCN) 基因以及GJB2基因編碼區擴增信息

圖1 線粒體tRNASer(UCN)基因G7444A突變測序峰圖

圖2 4個攜帶線粒體tRNASer(UCN) G7444A突變的耳聾家系圖

攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A基因突變非綜合征型耳聾家系11個先證者（見表2），男7個，女4個，測聽年齡4～24歲不等，發病年齡均在嬰幼兒時期（＜3歲）。其中3例無AmAn用藥史，11例患者均表現為雙耳對稱性聽力下降，聽力下降水平均為重度及以上。聽閾以高頻下降為主，PTA聽閾曲線以斜坡型居多。

表2 11個攜帶線粒體tRNASer(UCN) G7444A基因突變家系先證者臨床資料

2.2 耳聾相關突變熱點分析 線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變與非綜合征型耳聾相關[10]。該突變造成線粒體重鏈上COI基因終止密碼子AGA改變為AAA，導致COI基因翻譯出的多肽在羧基末端增加了3個氨基酸殘基（Lys、Gln和Lys）。同時，線粒體tRNASer(UCN)G7444A位點臨近輕鏈上tRNASer(UCN)前體3’端核酸外切酶的作用位點（見圖3）[9，12-13，20]，而且線粒體tRNA初級轉錄產物3’端多余核苷酸需在核酸外切酶的作用下從末端逐個切除[21]，因此，線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能影響tRNASer(UCN)的加工修飾。Guan等[22-23]發現tRNASer(UCN)前體上A7445G突變可造成tRNASer(UCN)前體加工缺陷，從而導致tRNASer(UCN)穩定性和ND6 mRNA量的明顯下降。而線粒體tRNASer(UCN)7444位點與7445位點位置相鄰，可能通過相似機制影響線粒體功能。

圖3 人類線粒體tRNASer(UCN)二級結構圖

本研究對收集的2 650例中國漢族非綜合征型耳聾樣本進行耳聾相關突變熱點分析發現，其中14例攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變，突變率為0.5%。在僅攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的LS40、RA119、HA186和HA115 4個家系中，考慮AmAn用藥史的情況下，外顯率分別為9%、37.5%、13.3%、6.7%；不考慮AmAn用藥史的情況下外顯率分別為0、25%、7.7%、0。表明線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能在AmAn性耳聾中發揮一定的作用。這11個中國漢族非綜合征型耳聾家系母系成員在聽力損失嚴重程度、發病年齡以及耳聾外顯率方面存在較大差異，推測除線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變在這些家系中發揮作用外，可能其他因素如核基因和線粒體背景等因素也發揮一定的作用。在11個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變耳聾家系中，母系人數共126人，其中26人發病，男16人，女10人。當包括和不包括AmAn使用史時，耳聾的平均外顯率分別為20.6%和10.3%，明顯高于只攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變家系耳聾外顯率，而這6個家系同時攜帶有其他突變位點（表3所示）。如NB133家系同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A和線粒體12S rRNA C1494T突變，外顯率高達42.9%。SX003、YJ042和YJ049 3個家系同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A和線粒體12S rRNA A1555G突變，平均發病率為29.4%。線粒體12S rRNA A1555G和C1494T突變是目前已知的與母系遺傳藥物性耳聾和非綜合征型耳聾發病密切相關的主要線粒體突變位點，世界各地已有多個相關報道[6，24-25]。不僅如此這幾個家系家系內和家系間的母系成員在聽力損失程度、發病年齡以及聽力臨床表型上都存在很大差異[17-19，26-29]。因此，推測在這6個家系中，線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能與線粒體12S rRNA A1555G和C1494T原發突變存在協同作用，共同影響非綜合征型耳聾的表型表達。除此之外，2001年，Abe等[30]報道了1個同時攜帶線粒體12S rRNA A1555G突變和GJB2基因突變的日本耳聾家系，并認為GJB2基因突變加重了mtDNA突變導致的耳聾表型。Kokotas等[31]也報道了一個同時攜帶GJB 235delG雜合突變和線粒體tRNASer(UCN)G7444A同質性突變的希臘耳聾家系。目前，僅在一些中國、日本、西班牙及希臘等耳聾家系中報道了GJB2基因突變和mtDNA突變協同致病現象[32]。本研究中發現的WLT024和WLT122家系同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A和GJB2 235delC-/-突變，家系耳聾平均外顯率為19.0%。耳聾外顯率與只攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變5個家系不考慮AmAn用藥史的情況下的平均外顯率差別不明顯，是否存在協同作用仍需要對家系進行深入調查，并進行進一步的功能驗證。

表3 11個攜帶線粒體tRNASer(UCN) G7444A突變耳聾家系臨床及分子遺傳學資料

3 討論

本研究探討了11個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A基因突變的中國漢族非綜合征型耳聾家系的臨床、家系、遺傳學特征及可能的分子致聾機制。這11個家系中，聽力障礙作為唯一的臨床表型僅存在于母系成員中（除同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和GJB2 235delC的家系外），提示在這11個家系中耳聾的發病與線粒體DNA的突變密切相關。同時針對耳聾相關的熱點突變篩查發現，在2 650例中國漢族非綜合征型耳聾患者中，14例攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變，突變率為0.53%，分屬于11個耳聾家系。在這11個攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變的家系中，其中同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G、12S rRNA C1494T或GJB2 c.235delC的家系分別為3、1和2個。這6個家系中家系內和家系間的母系成員在聽力損失程度、發病年齡以及聽力臨床表征上均存在很大差異。同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G、C1494T或GJB2 c.235delC突變的家系的耳聾平均外顯率分別為29.4%、42.9%和19.0%，而且同時攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G或C1494T突變家系耳聾的平均外顯率明顯高于只攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變耳聾家系的平均外顯率14.0%。提示在這11個中國漢族非綜合征型耳聾家系中，攜帶線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G、C1494T或GJB2 c.235delC突變的6個家系線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變可能與線粒體12S rRNA A1555G和C1494T原發突變存在協同作用，共同影響這些非中國漢族非綜合征型耳聾家系耳聾的表型。然而明確線粒體tRNASer(UCN)G7444A突變和線粒體12S rRNA A1555G或C1494T突變之間是否存在協同作用，進一步揭示母系遺傳性耳聾的分子致病機制仍需要深入開展功能驗證相關研究。

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