超微粉體夏天無(wú)指紋圖譜的研究

【摘要】目的建立夏天無(wú)超微粉體的HPLC指紋圖譜，為夏天無(wú)的質(zhì)量控制提供可靠方法。方法采用梯度洗脫進(jìn)行色譜分離，固定相為diamonsil BDS C18（5μm，250mm×4.6mm），流動(dòng)相為流動(dòng)相：A乙腈-B水（每1000mL水中加入冰乙酸30mL，三乙胺8mL），柱溫25℃，流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。結(jié)果初步建立了夏天無(wú)超微粉體的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了11個(gè)共有峰。結(jié)論建立的指紋圖譜可以較好地反映夏天無(wú)超微粉體的內(nèi)在質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】夏天無(wú)；超微粉體；HPLC指紋圖譜

夏天無(wú)為罌粟科植物伏生紫堇 Corydalis decumbens（Thunb）Pers.的干燥塊莖。主產(chǎn)于江西，在湖南、浙江、江蘇等地。為民間常用藥材，具有活血、祛瘀、通絡(luò)、行氣等功效，用于中風(fēng)偏癱、半身不遂等的治療。夏天無(wú)主要有效成分為生物堿類，2010年版《中國(guó)藥典》將原阿片堿（Pro），鹽酸巴馬汀（Pal）作為其定性和定量指標(biāo)。但這些成分存在于罌粟科的多種植物中，并非夏天無(wú)特有成分，而且僅采用一種或兩種成分對(duì)藥材進(jìn)行定性與定量，不能全面的反映其內(nèi)在質(zhì)量。本文采用HPLC法，對(duì)夏天無(wú)藥材進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究，建立了一種能較全面地反映藥材質(zhì)量，并進(jìn)行質(zhì)量控制的方法。

1儀器與試藥

Agilent 1200 HPLC（四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器）；Agilent Technologies 1200 Compact LC化學(xué)工作站；BFM-T6BI型貝利微粉機(jī)（濟(jì)南倍力粉體技術(shù)工程有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司生產(chǎn)），冰乙酸（色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），其它均為分析純，水為超純水。

原阿片堿（批號(hào)：110853-200402）﹑延胡索乙素（批號(hào)：110726-201011）﹑鹽酸巴馬汀（批號(hào)：110732-200907）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

夏天無(wú)藥材共10批（分別購(gòu)買與湖南、江西等地，經(jīng)湖南省中藥研究所鑒定均為罌粟科植物伏生紫堇夏天無(wú)Coydalis decumbens（Thunb.）Pers.的干燥塊莖。樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

2.2混合對(duì)照品配制取原阿片堿對(duì)照品10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加1%鹽酸溶液5mL使溶解，再加甲醇至刻度，搖勻。取鹽酸巴馬汀對(duì)照品10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取延胡索乙素對(duì)照品10mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加1%鹽酸溶液5mL使溶解，再加甲醇至刻度，搖勻。精密量取上述三種溶液各5mL，置同一25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1mL含原阿片堿40μg、延胡索乙素40μg、鹽酸巴馬汀20μg）。

2.3超微粉體樣品的制備[3-4]稱取夏天無(wú)粗粉200g于貝利粉碎機(jī)中，在最佳工藝條件下，進(jìn)行超微粉碎18分鐘，即得夏天無(wú)超微粉體。粒徑分布為0.567-153.943μm，D50[5]≤9.684μm，≤75μm的顆粒累積在98%以上。

2.4供試品溶液的制備取不同產(chǎn)地及市售10批夏天無(wú)超微粉1.0g，精密稱定，置100mL三角錐形瓶中，加入甲醇50mL，精密稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷后補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3指紋圖譜方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液（NO.2，江西2）10μL，按以上色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算其各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于1.6%，表明儀器精密度好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取夏天無(wú)超微粉（NO.2，江西2）6份，分別按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按擬定方法進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算其各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于1.6%，表明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試液（NO.2，江西2）10μL，分別在0，6，12，24，48h進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算其各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于1.7%，表明供試品溶液在48小時(shí)內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

3.1混合對(duì)照與樣品HPLC圖譜測(cè)定分別精密吸取混合對(duì)照與供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，記錄75分鐘的色譜圖。混合對(duì)照色譜見(jiàn)圖1，供試品色譜見(jiàn)圖2。

3.2指紋圖譜的建立[5]

3.2.1共有指紋峰的標(biāo)定[6]采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定共有指紋峰，以圖譜中原阿片堿色譜峰為參照物S峰，將各色譜峰保留時(shí)間與同一圖譜中參照物的保留時(shí)間比較，其比值為各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算10批夏天無(wú)供試品指紋圖譜中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間。其中11個(gè)色譜峰為各樣品所共有，故標(biāo)定它們?yōu)楣灿兄讣y峰。

3.2.2相似度評(píng)價(jià)采用中國(guó)藥典委員會(huì)出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)》軟件（2.0版）進(jìn)行相似度計(jì)算。

設(shè)置第一批樣品圖譜為參照物圖譜，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.50，多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，10批夏天無(wú)超微粉體的共有模式指紋圖譜見(jiàn)圖3。相似度計(jì)算結(jié)果表明，10批供試品的相似度均在0.90以上，見(jiàn)表3。

3.2.3聚類分析應(yīng)用軟件SPSS 16.0系統(tǒng)聚類法，對(duì)10批夏天無(wú)超微粉體的HPLC圖譜中各特征峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行分析，以歐氏平方距離為測(cè)度的聚類圖見(jiàn)圖4。從樹(shù)狀圖中可以看出，10個(gè)不同產(chǎn)地的夏天無(wú)樣品分為3類，10分為I類；6，9分為Ⅱ類；1，2，3，4，5，7，8分為Ⅲ類。

3.3分析與討論

3.3.1提取方法與溶劑的選擇

3.3.1.1生物堿成分提取對(duì)不同濃度的提取溶劑（甲醇、50%甲醇、含1%濃氨試液甲醇、含1%濃氨試液50%甲醇溶劑）提取方法（超聲、回流）進(jìn)行了考察。超聲提取出生物堿成分略低于回流提取，其中甲醇回流提取峰分離較好，達(dá)到基線分離，效果最好。因此，選擇甲醇回流提取，并且處理方法操作簡(jiǎn)便，快速可行。

3.3.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)，采用紫外吸收波長(zhǎng)掃描，在200-400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，色譜圖在280nm處特征性強(qiáng)，具有很好的代表性，故選用280nm作為夏天無(wú)生物堿HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3.1.3聚類分析結(jié)果應(yīng)用軟件SPSS16.0系統(tǒng)聚類法，對(duì)10批夏天無(wú)超微粉體的HPLC圖譜中各特征峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行分析，三類成分相對(duì)峰面積系統(tǒng)聚類分析結(jié)果比較可知10號(hào)（安徽亳州）單獨(dú)歸為一類，與含量結(jié)果相吻合，其質(zhì)量較差；6號(hào)，9號(hào)樣品在三類成分的系統(tǒng)聚類分析中歸屬有差別，其余樣品歸屬均相同。

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