植物染色體制片技術(shù)的比較研究

摘 要 本文以韭蘭為材料，對植物染色體常規(guī)壓片、去壁低滲法制片技術(shù)染色效果進行了比較。實驗表明：去壁低滲法獲得細胞和染色體都較分散，Giemsa染色使得背景與材料的對比度較大，便與觀察。不足之處在于去壁低滲過程中，時間特別不易掌握，耗材多，且成功率較低，染色體容易丟失、形態(tài)也不太理想。常規(guī)壓片耗材少，成功率較高，但不易做分帶制片。

關(guān)鍵詞 植物染色體；常規(guī)壓片；去壁低滲

一、材料與方法

1.供試材料試驗用植株由校園內(nèi)采集

2.根尖制片

（1）常規(guī)壓片。首先在早上9：00—10：00采集韭蘭的根，在室溫下放入0.1%秋水仙素溶液中進行預(yù)處理處理8h。然后在常溫下把材料放在卡諾氏固定液下固定10min，接下來就在1 mol/L鹽酸溶液中解離到松軟剛合適為止。最后用蒸餾水將韭蘭根沖洗干凈，這樣前處理就結(jié)束。處理完后就可以用醋酸洋紅染色或改良苯酚品紅染色。壓片/涂片后選取典型的染色體，在40倍物鏡及油鏡下顯微照相。

（2）去壁低滲法。首先把材料放0.1%秋水仙素溶液中進行預(yù)處理處理8h。然后前低滲，即將根尖放在0.075tool/LKCI低滲液中，在20-25℃條件下處理0.5h。接下來就是最關(guān)鍵的去壁，倒去KCI溶液，加入2.5%混合酶液，在25-30℃溫度下處理2-5h左右。去壁后要進行后低滲，使細胞完全膨脹，即是用20-30℃蒸餾水慢慢沖洗2-3次后，再將根尖放在0.075tool/LKCI低滲液中處理。將后低滲后的材料先經(jīng)固定液固定后，就可以把去壁固定的根尖放在清潔的載片上，將材料夾碎，加1滴固定液。放于酒精燈上微微加熱烤干。最后用Giemsa染色，后選取典型的染色體，在40倍物鏡及油鏡下顯微照相。

二、結(jié)果與分析

1.常規(guī)壓片法

常規(guī)壓片法操作簡單，醋酸洋紅對于染色體染色均勻，由于它對RNA也有染色效果，以此種方法染色的染色體十分飽滿，倘若制片操作合適，加上脫色、沉淀等步驟，能夠制出背景清晰、效果良好的裝片，可供染色體核型分析。但由于細胞壁的存在使染色體分散不完全，染色體易重疊。另外，由于染料原因，染色體與細胞質(zhì)反差小，不易于照相。醋酸洋紅的著色能力和分色效果會影響到顯微攝影的效果。

2.去壁低滲法制片

去壁低滲制片技術(shù)是利用前低滲先使細胞吸水膨脹，再經(jīng)酶解細胞壁，便于染色體分散。去除細胞壁是該技術(shù)的關(guān)鍵。此方法可以提高染色體的分散程度和平整性。用Giemsa染色獲得的染色體形態(tài)比較完整均一，染色體各組成部分——長臂、短臂、著絲點、隨體的顯示都比較清楚，有利于染色體的測量和分析。試驗中染色體種制片技術(shù)的效果對比著色深，此法所得制片背景十分清爽，為染色體形態(tài)數(shù)目的觀察創(chuàng)造了良好的條件。

3.去壁低滲染色注意事項

壓片法是最常用的方法，去壁低滲法是較新的一種方法。采用常規(guī)壓片方法簡便、快捷、經(jīng)濟、成功率高實用于材料較少的植物的核型分析制片，是研究細胞分裂和染色體動態(tài)變化首先使用的方法。但用壓片法制得的標(biāo)本片在脫片過程中染色體易丟失。采用去壁低滲法，可得到染色體分散好的細胞，特別是對染色體數(shù)目多、形態(tài)小的植物。去壁低滲法使植物染色體分帶成為可能，從而為更高層次的研究植物染色體奠定基礎(chǔ)。因此，進行染色體分帶時，去壁低滲法比壓片法更易獲得完整染色體組的分裂相。但在去壁低滲法中要注意以下幾個因素：

第一，在去壁過程中，酶解的時間特別不易掌握，受材料種類（單子葉植物，雙子葉植物）、大小及溫度的影響。因為酶在25℃時活性最強，因此在這種情況下，酶解多幾分鐘就很可能造成酶解過度，材料解體，找不到染色體。而酶解少幾分鐘就又有可能使得酶解不足，達不到去壁的目的，染色體分散不開。因而在溫度上建議使用低溫最好是0—3℃酶在0—3℃時活性就大大降低了，酶解也就比較緩和了。這樣酶解多或少幾十分鐘關(guān)系均不甚大。酶解時間變幅寬，就較易掌握了。

第二，酶解去壁后，低滲的時間也很難掌握，細胞酶解去壁后，剩下的只是質(zhì)膜了。這時，通過后低滲，水分子就會通過質(zhì)膜向細胞質(zhì)中滲透，使質(zhì)膜漸漸膨脹。如果細胞質(zhì)吸水過多，質(zhì)膜的伸展性達到極限，勢必脹破，同樣造成材料解體；吸水不足，細胞質(zhì)膨脹較小，體積小，染色體不能均勻地分散在細胞質(zhì)中，所得分散相也不會太好。根據(jù)滲透原理在溫度上建議使用低溫最好是0—3℃，因為滲透速度隨溫度升高而加快，也就是說，在0—3℃時物質(zhì)滲透速度比在25℃時要慢得多。因此在低溫下后低滲多或少幾十分鐘關(guān)系并不緊要。后低滲透時間變幅寬，就較容易掌握了。

第三，用火焰干燥制片時，務(wù)必使載片上有足夠的固定液。因為固定液過多，片上火焰燃燒時間長，染色體分散性可能較好，但染色體結(jié)構(gòu)易受破壞，往往出現(xiàn)解螺旋現(xiàn)象，反之，固定液過少則染色體分散度差。

選擇適宜的染色體制片方法，對于確定染色體數(shù)目、倍性水平、染色體形態(tài)等有助于植物細胞水平的遺傳變異研究。

參考文獻：

[1]朱徵.植物染色體及染色體技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，1982.

[2]張自立，俞新大.植物細胞和體細胞遺傳學(xué)技術(shù)與原理[M].北京：高等教育出版社，1990.

[3]劉祖洞，江紹慧.遺傳學(xué)實驗[M].北京：人民教育出版社，1979.

[4]章靜波.細胞生物學(xué)實用方法與技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，1990.

[5]李學(xué)，張方.植物染色體技術(shù)[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，1991.

[6]王新民.再談植物染色體標(biāo)本制備的去壁、低滲法[J].邯鄲農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報，1995（2）：34-37.

作者簡介：顏彥杰（1983-），男，四川遂寧人，遂寧二中實驗學(xué)校，中學(xué)二級，理學(xué)學(xué)士，主要從事中學(xué)生物教學(xué)工作。