人類微衛(wèi)星多重PCR擴(kuò)增體系的建立

摘要：采用碘化鉀法從血液中提取基因組ＤＮＡ，根據(jù)ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列設(shè)計(jì)引物，分析不同引物組合內(nèi)部可能出現(xiàn)的引物潛在配對(duì)作用，針對(duì)多重ＰＣＲ反應(yīng)體系中的引物、反應(yīng)緩沖液和鎂離子濃度設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組合。結(jié)果表明，２５ μＬ反應(yīng)體系中包含１．４×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，０．６ μｍｏｌ／Ｌ的各引物對(duì)濃度時(shí)，３對(duì)引物都能擴(kuò)增得到條帶清晰，亮度均一的目標(biāo)產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：多重ＰＣＲ；人類微衛(wèi)星；建立

中圖分類號(hào)：Q987.2；Ｑ７５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）18－3869-02

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｍａｒｋｅｒｓ

ＦＡＮ Ｊｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｅｓｈａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｅｓｈａｎ ６１４００４，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Gｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｕｓｉｎｇ ＫＩ， ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ， ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎs ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ， ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ａｎｄ Ｍｇ２＋ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｗｈｅｎ １．４×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ， ２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ０．６ μｍｏｌ／Ｌ ｏｆ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ｗere ｉｎ ｔｈｅ ２５ μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， ｃｌｅａｒ ｂａｎｄ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｌｕｍｉｎａｎｃｅ ｗas ａｍｐｌｉｆｉｅｄ with anyone of the 3 pairs of primers．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ； ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ； ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ

多重ＰＣＲ在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因擴(kuò)增，可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本，并可利用少量樣品去獲得盡可能多的遺傳信息［１，２］。本研究分析了３個(gè)人類微衛(wèi)星標(biāo)記Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ７Ｓ８２０和Ｄ５Ｓ８１８的多重ＰＣＲ擴(kuò)增體系中６條引物之間可能出現(xiàn)的引物潛在配對(duì)情況，并針對(duì)多重ＰＣＲ反應(yīng)體系中的引物濃度、ＰＣＲ反應(yīng)緩沖液和鎂離子的濃度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立了多重ＰＣＲ擴(kuò)增體系。

１材料與方法

１．１材料

ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶等購(gòu)自天根生化科技有限公司，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠，ＡｇＮＯ３和ＮａＯＨ購(gòu)自成都化學(xué)試劑廠。

１．２儀器

垂直電泳槽（北京鴻濤基業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司），電泳儀（北京六一儀器廠），ＰＴＣ－１００常規(guī)ＰＣＲ擴(kuò)增儀（美國(guó)ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司）。

１．３方法

１．３．１ＤＮＡ 提取參照文獻(xiàn)［３］方法并作適量改進(jìn)，取１００ μＬ枸櫞酸鈉抗凝血于１．５ ｍＬ離心管中，加入０．５ ｍＬ無(wú)菌水裂解紅細(xì)胞，高速離心去除上清，加入１００ μＬ ５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＩ，渦旋儀上震蕩數(shù)秒，室溫放置２～３ ｍｉｎ后加入１００ μＬ ０．９％ ＮａＣｌ和１５０ μＬ氯仿／異戊醇（２４∶１，Ｖ∶Ｖ），短暫振蕩后高速離心吸取上清并轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中，加入適量體積的醋酸鈉和異丙醇進(jìn)行ＤＮＡ沉淀，之后離心去除上清，５０ μＬ無(wú)菌水溶解ＤＮＡ，采用０．７％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)ＤＮＡ提取效果。

１．３．２引物設(shè)計(jì)及ＰＣＲ擴(kuò)增根據(jù)ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫(kù)中人類微衛(wèi)星位點(diǎn)Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ７Ｓ８２０和Ｄ５Ｓ８１８的序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０軟件設(shè)計(jì)ＰＣＲ引物，由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生命技術(shù)公司合成，具體信息見(jiàn)表１。ＰＣＲ反應(yīng)體系為２５ μＬ，含２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶０．５ μＬ，模板２．０ μＬ，選取ＰＣＲ緩沖液用量、ＭｇＣｌ２濃度和３對(duì)人類微衛(wèi)星基因引物的濃度共５個(gè)因素，設(shè)計(jì)１６個(gè)實(shí)驗(yàn)組合（表２），以篩選合適的反應(yīng)體系，最后用水補(bǔ)齊至２５ μＬ。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９５ ℃預(yù)變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性５０ ｓ，５６ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸４０ ｓ，３０個(gè)循環(huán)；７２℃延伸１０ ｍｉｎ；４ ℃保存。

１．３．３電泳及銀染檢測(cè)［４，５］ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物采用７％聚丙烯酰胺凝膠電泳，預(yù)電泳一段時(shí)間后在每個(gè)點(diǎn)樣孔點(diǎn)樣５ μＬ，２５０ Ｖ電壓進(jìn)行電泳，待電泳指示劑距離凝膠底部約３ ｃｍ時(shí)停止電泳，取出凝膠進(jìn)行銀染檢測(cè)ＤＮＡ。用雙蒸水快速洗滌凝膠１次，放入濃度０．１％的ＡｇＮＯ３染色液中輕輕振蕩１５ ｍｉｎ，用雙蒸水快速洗滌凝膠１～２次，再在顯色液（０．２５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ＋０．５％甲醛）中顯色至ＤＮＡ條帶清楚，立即倒掉顯色液并加入雙蒸水停止顯色，數(shù)碼相機(jī)拍照。

２結(jié)果

２．１提取的ＤＮＡ質(zhì)量檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示ＤＮＡ條帶致密、明亮清晰、無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明所提取的ＤＮＡ沒(méi)有發(fā)生降解，完整性較好（圖１）。

２．２引物配對(duì)互作形成二聚體潛力預(yù)測(cè)

“Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ”表示引物內(nèi)部配對(duì)的堿基對(duì)數(shù)減去錯(cuò)配的堿基對(duì)數(shù)，當(dāng)其低于８時(shí)表示形成引物二聚體的可能性較小。本實(shí)驗(yàn)涉及的６條引物只有Ｄ７Ｓ８２０基因上游引物（Ｆ）自身配對(duì)產(chǎn)生的“ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ”值為７，其余引物配對(duì)方式ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ值均在６以下，表明這些引物均不易形成二聚體。

２．３ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

將１６個(gè)實(shí)驗(yàn)組合的ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（圖２），可以看出ＰＣＲ緩沖液用量、ＭｇＣｌ２濃度和３對(duì)引物的濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有較大影響。目測(cè)各個(gè)基因擴(kuò)增條帶亮度的均一性，發(fā)現(xiàn)組合６中各個(gè)基因擴(kuò)增成功，主帶明顯且條帶亮度較為一致。組合４中雖然３個(gè)基因都有擴(kuò)增條帶，但其擴(kuò)增條帶亮度不均一，組合１２～１５中部分基因無(wú)肉眼可見(jiàn)的條帶產(chǎn)生。

３討論

本實(shí)驗(yàn)采取碘化鉀法從人體血液中提取基因組ＤＮＡ，并略加改進(jìn)，如在ＤＮＡ沉淀過(guò)程中加入適量醋酸鈉溶液并延長(zhǎng)沉淀時(shí)間至２～３ ｈ以促進(jìn)ＤＮＡ的沉淀。提取的ＤＮＡ條帶清晰，完整性好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

多重ＰＣＲ擴(kuò)增含有多對(duì)引物，各條引物之間可能發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)于具有ｎ對(duì)引物的多重ＰＣＲ體系，發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)的引物組合方式有２ｎ２＋ｎ種可能［6］。由于體系中各基因進(jìn)行特異擴(kuò)增的反應(yīng)參數(shù)存在一定的差異，不同引物對(duì)之間也可能存在和ＤＮＡ模板的競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增，導(dǎo)致擴(kuò)增時(shí)各基因擴(kuò)增條帶亮度不均一，甚至某些基因不能得到擴(kuò)增產(chǎn)物，因此兼顧各個(gè)基因自身特點(diǎn)，合理調(diào)整多重ＰＣＲ擴(kuò)增體系中影響因素的參數(shù)就顯得很重要。本研究中６條引物可以形成２１種引物配對(duì)組合，除Ｄ７Ｓ８２０基因上游引物自身配對(duì)產(chǎn)生的ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ值為７以外，其余引物配對(duì)產(chǎn)生的ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ值均在６以下，不易發(fā)生配對(duì)。在進(jìn)行多重ＰＣＲ反應(yīng)時(shí)，ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果所受影響因素較多，若在一次實(shí)驗(yàn)中獨(dú)立探討某個(gè)因素，則無(wú)法對(duì)其他因素進(jìn)行評(píng)估，將多種因素在多個(gè)水平上進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，能較快地找到反應(yīng)參數(shù)的最適組合［7］。本研究中電泳結(jié)果的判讀主要依靠肉眼目測(cè)，若要得到更客觀的評(píng)判結(jié)果，可采用凝膠掃描的方法對(duì)各條帶進(jìn)行精確定量測(cè)定［8］。對(duì)ＰＣＲ反應(yīng)的其他條件，如退火溫度，酶用量等，也還需進(jìn)一步的優(yōu)化，以得到更好的反應(yīng)條件。

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