五個山羊品種GDF9基因部分片段的多態性分析

摘要：以影響Ｂｅｌｃｌａｒｅ羊和Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ羊高產性能的生長分化因子9基因（ＧＤＦ９）的ＦｅｃＧＨ突變片段作為候選基因，采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法研究其在麻城黑山羊、宜昌白山羊、馬頭山羊、南江黃羊、波爾山羊５個品種中的多態性，結果未在５個山羊品種中檢測到ＧＤＦ９的ＦｅｃＧＨ突變，說明所檢測的ＧＤＦ９片段序列比較保守。

關鍵詞：山羊；生長分化因子９基因（ＧＤＦ９）；多態性；ＰＣＲ－ＲＦＬＰ

中圖分類號：Ｓ８５８．２７；Ｑ５０３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3863-03

Polymorphism Analysis of Partial Fragment of GDF9 in Five Goat Breeds

ＳＵＯ Ｘｉａｏ－ｊｕｎ，ＺＨＡＮＧ Ｎｉａｎ，ＸＩＯＮＧ Ｑｉ，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ，ＹＡＮＧ Ｑｉａｎ－ｐｉｎｇ，ＬＩＵ Ｙａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｍｉｎｇ－ｘｉｎ

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430209， China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ ＦｅｃＧＨ ｏｆ gene of ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ９（ＧＤＦ９） ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ the ｆｅｃｕｎｄｉｔｙ ｏｆ Ｂｅｌｃｌａｒｅ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ｅｗｅｓ ａｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅs， the ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍs ｉｎ Ｍａｃｈｅｎｇ ｇｏａｔｓ， Ｍａｔｏｕ ｇｏａｔｓ， Ｎａｎｊｉａｎｇ yｅｌｌｏｗ ｇｏａｔｓ， Ｙｉｃｈａｎｇ wｈｉｔｅ ｇｏａｔｓ ａｎｄ Ｂｏｅｒ gｏａｔｓ ｗere ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｎｏ ＦｅｃＧＨ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＤＦ９ ａｓ ｔｈａｔ ｉｎ Ｂｅｌｃｌａｒｅ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ｅｗｅｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＧＤＦ９ ｗａｓ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｏａｔ； gene of ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ９（ＧＤＦ９）； ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ； ＰＣＲ－ＲＦＬＰ

生長分化因子９（Ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ９，ＧＤＦ９）屬于轉化生長因子-β（ＴＧＦ-β）超家族成員，對早期卵泡的生長和分化起到重要的調節作用［１－３］。綿羊ＧＤＦ９基因位于５號染色體上，由２個外顯子和１個內含子組成；第一外顯子長３９７ ｂｐ，編碼１～１３４位氨基酸，第二外顯子長９６８ ｂｐ，編碼１３５～４５６位氨基酸，內含子長１ １２６ｂｐ［４，５］。Ｈａｎｒａｈａｎ等［６］在Ｂｅｌｃｌａｒｅ羊和Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ羊ＧＤＦ９基因編碼區分別發現了８個點突變，發現其中以ＧＤＦ９基因編碼區第二外顯子１ １８４ ｂｐ處Ｃ→Ｔ的ＦｅｃＧＨ突變對卵巢發育具有重要調節作用，且在群體中自然突變率較高，ＦｅｃＧＨ突變又稱Ｇ８突變（Ｇ代表ＧＤＦ９基因，Ｈ為高繁殖力的意思）。然而關于麻城黑山羊、宜昌白山羊、馬頭山羊、南江黃羊及波爾山羊品種是否存在ＧＤＦ９基因的相應突變，目前尚未見報道。該研究以繁殖力不同的麻城黑山羊、馬頭山羊、南江黃羊、宜昌白山羊和波爾山羊為試驗材料［７］，采用PCR-ＲＦＬＰ方法對在繁殖中起重要作用的ＧＤＦ９基因進行多態性檢測，以比較ＧＤＦ９基因在不同品種中的多態性，并對其ＧＤＦ９基因片段進行測序比較分析，旨在尋找與產羔數相關的遺傳標記，為山羊高繁殖力的標記輔助選擇和分子育種提供理論依據。

１材料與方法

１．１試驗材料

采集具第１、２胎產羔數記錄的母山羊血樣，其中麻城黑山羊４０只，血樣采自麻城市種羊場（湖北省麻城市）；南江黃羊３０只，血樣采自湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所種羊場（湖北省武漢市）；宜昌白山羊、波爾山羊各４０只，血樣采自湖北省種羊場（湖北省宜都市）；馬頭山羊６０只，血樣采自湖北鄖西縣馬頭山羊種羊場（湖北省鄖西縣）。頸靜脈采血，每只采１０ｍＬ，ＥＤＴＡ抗凝，－２０℃凍存。采用酚氯仿抽提法提取基因組ＤＮＡ，溶于1×ＴＥ液，４℃保存。

１．２主要試劑

限制性內切酶ＤｄｅⅠ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ載體及ＤＮＡ片段回收純化試劑盒等均購自武漢生命技術有限公司。

１．３引物設計和ＰＣＲ擴增

根據Ｈａｎｒａｈａｎ等［6］的方法在上游引物３′末端倒數第三個位置引入錯配堿基Ｔ（下劃線）則會產生一個限制性酶ＤｄｅⅠ酶切位點，擴增產物大小為１３９ｂｐ，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，上游引物序列：５′－ＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴ

ＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡ－３′；下游引物序列：５′－ＣＴＴＴＡＧＴＣＡ

ＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣ－３′。ＰＣＲ反應總體積為２５．０ μＬ，各組分如下：１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ） ０．４ μＬ，上、下游引物量（２０μｍｏｌ）各０．３ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（5 Ｕ／μＬ） ０．３μＬ， Ｍｇ２＋（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）１．５ μＬ，模板ＤＮＡ（１００ ｎｇ／μＬ） ２．０ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １７．７ μＬ；反應程序如下：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ，９４ ℃變性３０ ｓ、６２ ℃退火３０ ｓ、７２ ℃延伸３０ ｓ進行３２個循環，７２ ℃總延伸５ ｍｉｎ，４ ℃保存。

１．４PCR-ＲＦＬＰ分析

ＰＣＲ產物用限制性內切酶ＤｄｅⅠ酶切，酶切體系：反應總體積為２０ μＬ，其中ＰＣＲ產物８ μＬ，２ U/μＬ限制性內切酶ＤｄｅⅠ ２ μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ １０ μＬ，３７ ℃酶切過夜，將酶切產物上樣于３％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，電泳結束后，對酶切電泳條帶進行PCR-ＲＦＬＰ分析。

１．５克隆測序

采用低熔點瓊脂糖凝膠回收ＰＣＲ擴增目的片段，將其連接到ｐＧＥＭ－Ｔ ＥＡＳＹ載體，并轉化大腸桿菌ＤＨ５α菌株，鋪板，３７ ℃過夜培養后挑取白色單菌落，進行重組質粒快速鑒定，隨機選出２個含有目的片段的重組子由上海英駿生物技術有限公司進行ＤＮＡ測序，序列用ＤＮＡＭＡＮ軟件進行分析。

２結果與分析

２．１ＰＣＲ產物的檢測結果

ＰＣＲ產物經３％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在１３９ｂｐ處出現明顯的ＤＮＡ擴增帶，與預期的ＧＤＦ９基因片段大小一致（圖１）。

２．２ＰＣＲ－ＲＦＬＰ電泳結果與分析

用限制性內切酶ＤｄｅⅠ對ＰＣＲ產物（１３９ｂｐ）進行酶切，用３％的瓊脂糖凝膠對酶切產物進行檢測。結果所有個體的PCR產物都被ＤｄｅⅠ完全切開，得到兩個酶切條帶（圖中只顯示１０８ ｂｐ，３１ ｂｐ條帶由于太弱圖片上沒有顯示），不存在多態性，都為野生型純合子（圖２）。

２．３基因序列分析

克隆的ＧＤＦ９基因為１３９ｂｐ，山羊ＧＤＦ９基因序列與已報道的綿羊（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＡＦ０７８５４５）、豬（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＣＵ４０７０３８）、牛（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＡＹ１９２０１８）、人（ＧｅｎＢａｎｋ登錄號：ＮＭ＿００５２６０）ＧＤＦ９基因的對應序列用ＤＮＡＭＡＮ軟件進行同源性比較，同源性分別為９８％、９４％、９５％、９３％，表明克隆片段為山羊ＧＤＦ９基因序列。

山羊ＧＤＦ９基因克隆片段與綿羊相應序列比較存在兩處多態位點：即山羊４ ０７１位發生Ｃ→Ｔ的堿基突變，４ ０９１位發生Ｃ→Ａ的堿基突變（圖３）。

３討論

研究［８－１０］表明，ＧＤＦ９基因在人、嚙齒類動物以及反芻家畜卵母細胞中特異表達，對卵巢卵泡的發育起重要調節作用。ＧＤＦ９基因可以促進原始卵泡向初級卵泡發育，ＧＤＦ９基因的缺失使初級卵泡不能形成，從而導致雌性不育，另外ＧＤＦ９還可以與其他激素／生長因子如ＧＤＦ９Ｂ、ＦＳＨ、ＦｅｃＸＩ協同作用。Ｈａｎｒａｈａｎ等［６］發現ＦｅｃＧＨ純合子Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ母羊和Ｂｅｌｃｌａｒｅ母羊都不育，而雜合子ＦｅｃＧＨ／ＦｅｃＧ＋母羊比野生型ＦｅｃＧ＋／ＦｅｃＧ＋母羊排卵數多，ＦｅｃＧＨ在Ｂｅｌｃｌａｒｅ母羊和Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ母羊中的排卵數效應估計值分別為（１．７９±０．５４８）枚（Ｐ＜０．０１）和（２．３５±０．３８６）枚（Ｐ＜０．０１），表明在Ｂｅｌｃｌａｒｅ母羊和Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ母羊中存在影響其排卵數的主效基因。因此，可以將ＧＤＦ９基因作為山羊繁殖性狀的候選基因來研究。

目前對ＧＤＦ９基因的研究多集中于綿羊，對山羊的研究甚少。該研究采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法對５種山羊ＧＤＦ９基因ＦｅｃＧＨ突變作檢測，結果未檢測到ＦｅｃＧＨ突變，發現山羊ＧＤＦ９基因與綿羊有很高同源性，與牛、豬、人同源性次之，山羊ＧＤＦ９基因片段較綿羊存在兩處多態位點，說明ＧＤＦ９基因在不同物種間存在較大差異，而在綿羊和山羊間高度保守，因此ＧＤＦ９基因ＦｅｃＧＨ突變是否具有種屬特異性，即只存在于綿羊而不存在于山羊中，仍需進一步擴大樣本進行驗證，鑒于該基因的重要作用，基于全基因序列和大樣本群體的相關性分析仍很有必要，應當檢測ＧＤＦ９基因ＤＮＡ全序列在５種山羊中的堿基突變情況，從整體上研究ＧＤＦ９基因與５種山羊高繁殖力之間的關系，尋找控制山羊產羔性狀的主效基因，并最終為提高山羊的繁殖性能、提高產羔率提供理論依據。

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