骨髓間充質干細胞對大鼠損傷汗腺的修復性研究

[摘要] 目的 探討皮膚汗腺受損后骨髓間充質干細胞對其的修復效果。方法 大鼠骨髓間充質干細胞體外分離、培養、標記。機械損傷大鼠腳掌汗腺，干細胞治療組于創面周圍皮下注入MSCs，對照組注射相同劑量PBS，分別比較兩組的創面愈合率及再生上皮的厚度，觀察MSCs參與受損汗腺修復的情況。結果 7 d時干細胞治療組的創面愈合率及14 d時的表皮再生厚度均優于對照組（P<0.05）；BrdU標記的MSCs參與了損傷汗腺導管部的修復。結論 骨髓間充質干細胞有利于創傷皮膚的修復并可能參與損傷汗腺的修復。

[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞；損傷修復；汗腺

[中圖分類號] R64 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）36-0007-03

The study of the participation of MSCs in the repair of injured skin and sweat glands in rats

WANG Jun ZHANG Haifeng SHEN Xiaoling LI Cunbao

Basic Medical College of Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110， China

[Abstract] Objective To explore the repair effects of injured skin and sweat glands. Methods Rats MSCs were isolated，grown and labelled in vitro. The model of injured sweat glands of sales was made in rats. The 5-BrdU-labelled mesenchyme stem cell（MSCs） suspension was injected in rats of experimentation group，and PBS with the equivalent volume in rats of the control group. The sole tissues were required and underwent HE staining from the two groups. The immunochemical staining was performed to observe the distribution of MSCs in the injured area. Results The healing ratio and the depth of re-epithelialization in experimentation group were both higher than the control group（P<0.05）. Immunochemical staining showed BrdU-positive cells in the sweat gland ducts during the healing process. Conclusion Mesenchyme stem cells may participate in the healing process of injured skin and sweat glands.

[Key words] Mesenchymal stem cells； Wound repair； Sweat glands

近十余年來組織工程學的發展為大面積皮膚缺損的修復開辟了新的途徑，大量人工皮膚的問世雖然可以實現外觀的修復但不能滿足根本的功能需要，存在的一個共同問題是均不能重建毛囊、皮脂腺、汗腺等皮膚附屬器，降低了皮膚對環境的適應能力。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）多向分化潛能的深入研究，使得重建損傷皮膚附屬器成為可能。本實驗觀察MSCs對于大鼠腳掌損傷汗腺的修復情況，期望以此為基礎實現皮膚功能的完全修復。

1 材料與方法

1.1 MSCs的分離、純化及傳代

無菌條件下取成年雄性Wistar大鼠（由中科院實驗動物所提供）兩側股骨，用含有胎牛血清（體積分數為10%）的DMEM培養液沖出骨髓細胞，1000 rpm/min離心7 min，DMEM重懸，以2×105 cm2細胞接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2的孵箱中培養，2 d后更換培養基，棄除未貼壁細胞。以后每隔2～3天細胞換液1次。細胞達80%融合后用2.5 g/L的胰蛋白酶和0.2 g/L的乙二胺四乙酸（EDTA）于37℃消化，然后以1∶3的比例接種于新的培養瓶進行傳代擴增。

1.2 MSCs的標記

在傳至第三代后，以含5 μmol/mL 5-溴脫氧尿嘧啶（5-BrdU，美國Sigma公司）的上述培養液孵育。移植前0.25%胰酶（含0.02% EDTA）室溫下消化、800 rpm離心10 min、磷酸鹽緩沖液反復沖洗3遍，并同時調整細胞濃度為4.0×106/mL。

1.3 動物分組及模型制備

Wistar雄性大鼠100只，平均體重200 g 左右（由內蒙古大學動物實驗中心提供）。隨機分為干細胞治療組和對照組。氯胺酮（10 mg/kg）腹腔注射麻醉，75%乙醇消毒，無菌刀片輕刮雙側腳掌，造成皮膚汗腺的損傷。干細胞治療組于創傷周圍組織皮下注入300 μL MSCs細胞懸液，對照組注入等體積PBS。無菌紗布覆蓋。分別于處理后的7 d和14 d，每組取出25只大鼠，切除創傷腳掌，4%多聚甲醛固定，去除骨組織，石蠟包埋，5 μm連續切片，備用。

1.4 HE染色

石蠟切片常規脫蠟至水，用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，光鏡下觀察。比較7 d時兩組的創面愈合率，觀察14 d時兩組新生上皮增生情況，通過顯微鏡目鏡測微器測量再生的表皮厚度。

1.5 免疫組織化學染色

采用二步法對連續切片進行免疫組織化學染色，嚴格按照中杉公司提供的免疫組織化學染色試劑盒說明書操作。鼠抗BrdU單克隆抗體（北京中杉公司）工作濃度1∶100，室溫下孵育4 h，洗片，加羊抗鼠二抗（北京中杉公司），室溫下孵育2 h、洗片，3，3 二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察染色結果，細胞核呈棕黃色者為BrdU陽性細胞。

1.6 統計學方法

治療組、對照組14 d再生上皮的厚度以（x±s）表示，組間差異采用t檢驗，7 d愈合率用卡方檢驗進行比較，使用SPSS11.0統計學軟件分析，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

骨髓MSCs原代經過2 d培養后有少量貼壁細胞，3 d可見多個貼壁細胞的克隆，細胞成梭形，細胞核大，胞漿豐富（圖1 A）。培養7 d后，細胞迅速增殖（圖1 B），11 d后出現細胞融合及重疊，14 d可傳代，傳代后細胞于24 h內完全貼壁。傳3代后MSCs生長達到最佳狀態。

圖1 鼠MSCs培養第3 天（A，倒置相差顯微鏡）和第7天（B，倒置相差顯微鏡）形態；BrdU標記（C，DAB染色）

移植前對標記細胞MSCs進行細胞化學染色（圖1 C），以鑒定其標記比例。結果顯示BrdU標記的MSCs陽性率達90%以上，達到移植要求。

實驗處理7 d后，組織切片HE染色顯示，組織間炎癥細胞浸潤，干細胞治療組創面完全愈合，明顯優于對照組創面愈合率（100% vs 72%，χ2=5.98，P<0.05）， 且明顯出現角質層（表1，圖2 A，B）。實驗處理14 d后炎癥反應逐漸消退，干細胞治療組中表皮層厚度為（82.560±9.815）μm，略有表皮角形成，優于對照組創面再生表皮厚度（54.280±8.672）μm（t=3.972，P<0.05），見表2，圖2 C，D。

免疫組化染色結果顯示，干細胞治療組在創傷14 d后，真皮層中可見散在分布BrdU陽性細胞，且在汗腺導管處易觀察到BrdU陽性細胞，可見其所標記的MSCs可能參與了損傷汗腺導管的修復。對照組中未發現類似現象（圖2 E，F）。

表1 7 d愈合率

注：χ2=5.98，P<0.05

表2 14 d再生表皮厚度的差異

注：t=3.972，P<0.05

3 討論

間充質干細胞在一定的條件下可以分化為多樣的細胞譜系，如肌腱細胞[1]、骨細胞[2]和軟骨等[3]。這種能夠產生多種效能的細胞不僅來源于骨髓組織同時可來源于非骨髓組織，如胎兒臍血、脂肪組織[4]、肌肉組織和牙髓。這些細胞因為其與宿主高度的同一性，因此具有較低的免疫原性。近年來，對于干細胞的潛在治療應用被廣泛的研究，研究人員普遍認為，大量健康干細胞的分離獲取，選擇更方便的治療路徑，規范干細胞分化為特定的細胞類型是在干細胞治療過程中極為重要的環節。

近年來MSCs應用于皮膚疾病的治療得到大量報道，尤其是其在實驗模型或臨床研究中，對于創傷皮膚的修復作用更是引起了人們的重視。人們普遍認為這一細胞可以成為創面修復過程中重要的基質細胞，將成為今后細胞治療創面修復的重要方式。MSCs對于創傷皮膚的治療主要通過其直接參與了組織細胞的分化，同時為周圍細胞的修復提供了一個微環境，通過對于炎性細胞分泌的細胞活性因子及干細胞壁龕實現對于創傷皮膚的再生。同時其產生了大量的生長因子和免疫調節因子，對于創面的愈合恢復表現為積極的作用[5]。目前對于皮膚創傷的治療更多的還是考慮創面的恢復，表皮層的有效覆蓋。但我們也清晰地認識到，皮膚修復是一個復雜的過程，單純皮膚結構的解剖學恢復，不能解決因皮膚缺損而引起的功能學障礙，如何真正的實現皮膚的功能的恢復和重建，是當今對于皮膚創傷修復研究的重要任務[6]。

結合皮膚正常的生理結構和功能，我們認為，對于皮膚附屬器的重建又以汗腺的功能重建最為重要。而MSCs在與汗腺細胞的共培養和其在體外誘導汗腺細胞的分化[7，8]，使得我們認識到，利用干細胞的特定分化的特性和周圍微環境對于其誘導分化的影響，通過調控MSCs增殖分化潛能的細胞外微環境，誘導其分化，以重建皮膚附屬器，實現真正意義上的創傷皮膚的解剖學和功能學的恢復。

通過實驗研究我們發現，MSCs可以促進創傷皮膚的修復，創面的恢復速度和再生上皮的厚度均明顯的優于對照組，與當前的研究相吻合[9]。在修復的過程之中其不但參與了皮膚組織結構的重建，同時參與了受損汗腺的修復重建，對于提升創面修復質量起到積極的促進作用。雖然在當前的研究中，我們還未能實現大量的MSCs參與受損汗腺的修復過程，且不能明確其是否實現了功能性的修復，但至少為今后的研究奠定了進一步基礎，具有重要的現實意義和臨床意義。然而當前我們并未實現受損皮膚真正的“功能型”恢復，且MSCs誘導分化的確切機制仍然不是很明確，仍需進一步的研究。但是，當前對于皮膚生物學的研究不斷深入，MSCs臨床治療的不斷探討，可以預見的是，在今后MSCs必將成為一個重要的臨床治療手段，并在皮膚創傷的治療中展現出廣闊的應用前景。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-11-08）