皮鱗癌一號方誘導(dǎo)人皮鱗癌A431細(xì)胞凋亡作用探討

摘要：目的：探討皮鱗癌一號方對皮鱗癌A431細(xì)胞凋亡率的影響。方法：不同濃度的皮鱗癌一號方作用于A431細(xì)胞24h、48h、72h后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測顯示，皮鱗癌一號方作用48后，隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞周期被明顯阻制在G0/G1期，凋亡率增高，與對照組比較差異有顯著性（P <0.05）。結(jié)論：皮鱗癌一號方具有誘導(dǎo)人皮鱗癌A431細(xì)胞凋亡作用，并能阻滯細(xì)胞于G0/G1期，阻止S期DNA的合成和復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞：皮鱗癌一號方；A431細(xì)胞；凋亡率

中圖分類號：R329.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-0515（2013）9-031-02

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）簡稱皮鱗癌，發(fā)病率在皮膚非黑色素細(xì)胞癌中僅次于基底細(xì)胞癌。近年來，由于環(huán)境污染、臭氧層的破壞和人們戶外活動的增加，皮鱗癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。SCC系起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的一種惡性腫瘤，目前主要治療方法包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、冷凍治療等等，但各種治療方法都存在一定的不足。而且，皮膚鱗癌轉(zhuǎn)移后的治療仍是尚待解決的難題。因此，尋求新的、有效的解決方法仍是目前臨床急需解決的問題。

本實驗選取的皮鱗癌一號方由遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校提供，每ml試液相當(dāng)于生藥2g，以其中所含白頭翁中的三萜類皂苷含量作為質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過體外實驗，從皮鱗癌A431細(xì)胞凋亡率方面探討皮鱗癌一號方對SCC的影響。

1 材料

1.1藥物 皮鱗一號方由白頭翁、莪術(shù)等中藥組成，試驗品由遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校提供，每ml相當(dāng)于生藥2g，以白頭翁皂苷B4含量及浸膏收率作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 高糖的DMEM、胎牛血清購自Hyclone公司，MTT購自Amresco公司（201105）。

1.3 細(xì)胞系 A431細(xì)胞購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A431細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素（100U/L）和鏈霉素（100U/L）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃和飽和濕度的培養(yǎng)箱中。

2.2 MTT法測定皮鱗癌一號方對A431細(xì)胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.25×105/ml，160μl/孔接種于96孔板。培養(yǎng)24h后，每孔加40μl不同濃度的藥物，藥物濃度設(shè)5個梯度，分別為原藥的1/400、1/200、1/100、1/50、1/25。同時設(shè)空白調(diào)零組（加200μl無血清培養(yǎng)基）、陰性對照組（不加藥物）、陽性對照組（5-Fu10μg/ml）。因皮鱗癌一號方有顏色，加設(shè)不同濃度顏色對照組。分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，棄去上清，加200μl無血清培養(yǎng)基及20μlMTT（5mg/ml），置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，棄上清，加150μlDMSO，振蕩10min后，于酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測定吸光度值（OD值）。實驗重復(fù)三次。

流式細(xì)胞儀檢測及分析 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以6.25×105/ml的細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48h后，待細(xì)胞長滿瓶底約50%-60%，隨機分組，各組給予相應(yīng)的干預(yù)因素，陰性對照組加入等量無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，收集用藥組和陰性對照組各組細(xì)胞上清，用胰酶消化細(xì)胞后，與上清一起離心，1000r/min，3min。

調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106 /ml，小心棄去上清，加PBS清洗2遍，加入1ml冰乙醇，-20℃固定過夜。陰性對照管加入100μl細(xì)胞懸液，樣本管每管加2.5μl Annexin V/FITC、2.5μlPI，加入100μl細(xì)胞懸液，混勻后室溫避光孵育30min。采用流式細(xì)胞儀檢測。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有計量資料用 表示，多組間比較采用單因素方差分析，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，并以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。P<0.05時認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

Annexin V/PI雙染細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡率

根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，其左上象限UL代表機械性損傷導(dǎo)致的細(xì)胞碎片；右上象限UR代表晚期凋亡細(xì)胞或者死亡細(xì)胞；左下象限LL代表陰性正常細(xì)胞；右下象限LR代表早期凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，與陰性對照組比較，中藥復(fù)方制劑組G0/G1期細(xì)胞較陰性對照組增多，S期、G2/M期細(xì)胞減少。其中中藥復(fù)方制劑高劑量組G0/G1期較陰性對照組增高，S期較陰性對照組降低，具有顯著性差異（P<0.05）。與陰性對照組比較，中藥復(fù)方制劑組凋亡率明顯高于陰性對照組，具有顯著性差異（P<0.05）。

4討論

細(xì)胞凋亡是機體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的程序化死亡過程。細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞死亡的一種主要方式，在腫瘤形成過程中有相當(dāng)重要的地位[1]。皮膚癌與其他惡性腫瘤一樣，也是一個多步驟、多因素參與的過程。而其中重要的原因之一就是細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡[2]。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期各時相分布以及凋亡率，已經(jīng)是腫瘤分子的生物學(xué)研究、抗腫瘤藥物機制研究中的一項重要技術(shù)。近年來，越來越多的學(xué)者應(yīng)用現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)對中藥抗腫瘤的機制進(jìn)行深入研究。本實驗中，皮鱗癌一號方對A431細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且隨著藥物濃度的增加以及作用時間的延長，其抑制率越明顯。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀檢測皮鱗癌一號方作用后凋亡率的變化[2]，結(jié)果表明，與對照組比較，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少。提示皮鱗癌一號方阻止腫瘤細(xì)胞在G0/G1期，抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期。而且隨著藥物濃度的增高，腫瘤細(xì)胞的凋亡率亦增高。

本實驗揭示皮鱗癌一號方可明顯的誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡的作用。

參考文獻(xiàn)：

1. Chaudhry MA.Base excision repair of ionizing radiation-induced DNA damagein G1 and G2 cell cycle phases[J].Cancer Cell Int，2007，（7）：15.

2. Sitko JC，Yeh B，Kim M，et a1.SOCS3 regulates p21 expression and cell cycle arrest in response to DNA damage[J].Cell Signal，2008.20（12）：2221-2230.