內毒素誘導大鼠心肌損傷時EPO及EPOR表達的實驗研究

[摘要] 目的 觀察內毒素誘導大鼠心肌損傷時EPO 及EPO受體表達。 方法 20只雄性SD大鼠隨機分為LPS組和對照組，LPS組腹腔注射生理鹽水，連續處理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，建立內毒素心肌損傷模型。對照組與LPS組腹腔注射等量生理鹽水。腹腔注射6 h后于鼠尾部放血測定心肌損傷標志物，斷頸活殺取出心臟組織測定EPO 及EPO受體濃度。 結果 LPS組血清心肌損傷標志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）水平均顯著高于對照組（t = 6.751、5.346、3.432，P < 0.05）。LPS組心臟組織EPO及EPO受體水平均顯著高于對照組（t = 2.587、4.306，P < 0.05）。 結論 內毒素誘導大鼠心肌損傷時存在EPO及EPO受體高表達，為外原性EPO在膿毒癥的心臟保護中的應用提供了可行性。

[關鍵詞] 內毒素；心肌損傷；促紅細胞生成素；促紅細胞生成素受體；動物實驗

[中圖分類號] R363.1+4 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）18-0008-03

膿毒癥是臨床常見危重病之一，膿毒癥已成為世界上ICU患者死亡的主要原因，膿毒癥休克患者死亡率高達46.5%[1]。嚴重膿毒癥時心肌抑制的發生率高達 80%，發生心肌損傷達 40%，嚴重影響患者的預后[2]。細菌產生的內毒素釋放入血是膿毒癥發生的關鍵，內毒素可誘導機體出現全身炎癥反應綜合征從而造成多臟器損傷，特別是引起心肌抑制和心肌損傷，而目前對于膿毒癥心肌抑制和心肌損傷尚無有效的治療方法。促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種糖蛋白造血細胞生長因子，主要由人體中的腎小管周圍毛細血管床的間質細胞產生，EPO與促紅細胞生成素受體（EPOR）結合調控紅系干細胞增殖、分化、成熟，促進網織紅細胞釋放入血的生物學作用。近幾年的研究發現[3]，在發生貧血、缺氧、急性損傷等情況下則能夠對 EPO 及其受體的產生起到負反饋調節作用。因此，本課題組于2009年11月～2010年1月通過內毒素誘導大鼠心肌損傷，并采用ELISA法測定心臟組織中EPO及EPOR濃度，以探討其可能的保護機制。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS， L2880）、3-去氮腺苷（3-deazaadenosine）、EPO（CSB-E04539 m）及EPO受體（CSB-E0732l m）均為 Sigma公司產品，ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。其他試劑均為國產分析純，水為去離子水。

1.2 實驗動物

健康雄性SD大鼠20只，（體重300～320 g，SPF級，華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供），按清潔級大鼠的要求標準飼養。20只大鼠隨機分為脂多糖（LPS）組和對照組各10只。LPS組腹腔注射生理鹽水，連續處理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，建立內毒素心肌損傷模型[4]。對照組與LPS組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3觀察指標

①心肌損傷標志物測定：腹腔注射6 h后于鼠尾部放血約0.5 mL/只，低溫3000轉/min離心15 min分取血清，置-20℃冰箱保存備用待測心肌損傷標志物，包括：心肌肌鈣蛋白I（cTnⅠ）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量，采用ELISA檢測心肌損傷標志物的濃度，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。②EPO及EPOR濃度的測定：腹腔注射6 h后鼠尾部放血后立即斷頸活殺取出心臟組織于-20℃保存，然后取心肌組織標本在冰凍條件下研磨，制備心肌組織勻漿液，采用ELISA檢測EPO及EPOR濃度，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行，反應終止后用酶標儀在450 nm測定A值，先測得樣本的A值，根據標準品的濃度及A值計算出EPO及EPOR的相對濃度。

1.4 統計學處理

計量資料用均數±標準差（x±s）表示，應用SPSS 13.0數據分析軟件進行數據分析，各組間EPO及EPOR和心肌損傷標志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS組和對照組大鼠心肌損傷標志物水平檢測結果比較

大鼠在腹腔注藥6 h后測定血清心肌損傷標志物水平，結果顯示，LPS組大鼠血清心肌損傷標志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）水平均顯著高于對照組（t =6.751、5.346、3.432，P < 0.01）。見表1。

3討論

目前，我國膿毒癥患者的死亡率居高不下，約為20%～40%，其中50%的膿毒癥患者出現心肌受損[5]，防治內毒素性心肌損傷對降低膿毒癥患者的死亡率具有十分重要的意義。LPS是由O-抗原、核心多糖和類脂A三部分構成的革蘭陰性細菌外表層的一種生物大分子，其中只有LPS分子的類脂A基團具有內毒素活性，細菌類脂A基團一旦侵入人體內可以誘發多種疾病[6]。感染性休克、敗血癥、多器官功能性衰竭等臨床常見的革蘭陰性菌所致的疾病均與類脂A密切相關[7]。國外的研究報道[8]，內毒素可以激發多細胞因子參與機體反應，并誘導心肌細胞凋亡，這可能是導致心肌損傷的重要機制之一。cTnⅠ、CK、CK-MB是反應心肌細胞損傷較為敏感的指標。當心肌細胞因缺血、缺氧等因素發生變性壞死，cTnI外漏并通過受損的細胞膜彌散進入細胞間質，隨之進入血管引起血清cTnI的升高[9]。CK-MB是一種細胞內酶，當心肌缺血或者再灌注損傷時，細胞膜通透性升高導致細胞內的CK、CK-MB大量入血[10]。CK和CK-MB特異性地反映心肌細胞受損程度，血清中CK和CK-MB越高，則表明心肌受損越嚴重。本研究在腹注LPS后，LPS組大鼠血清cTnⅠ、CK 、CK-MB水平顯著高于對照組，提示LPS能引起心臟組織功能的病理學改變，同時也提示本研究建立內毒素心肌損傷模型是成功的。

人類EPO基因由 166 個氨基酸殘基組成，定位于 7 號染色體長臂 22 區（7q22），體內EPO主要由低氧誘導產生，腎臟分泌入循環。EPO的作用是維持紅細胞造血前體細胞的存活并促進其分裂，誘導晚期紅系祖細胞生長成為成熟的紅細胞[11]。EPO促進紅細胞生成的生物學效應主要是通過位于骨髓紅系祖細胞表面的特異性 EPO 受體來完成的，EPO及EPOR結合發揮生物活性，激活多種信號轉導途徑發揮抗凋亡作用[12]。據研究報道[13]，EPO及EPOR的高表達可能與多種惡性腫瘤的發生和發展、新生血管生成有著密切的關系；此外，EPO及EPOR信號途徑在生理及病理的促進心、腦損傷修復等多方面起重要作用[14]。近年來，EPO 參與胚胎的正常發育、促進血管生成、組織保護作用、抑制炎癥反應、抗氧化作用等多種非造血生物作用成為研究的熱點。但目前尚無證據證明EPO及EPOR在心肌損傷是否也存在其表達水平上調尚不清楚，有內毒素性心肌損傷的發病機制還存有爭議，因此，本研究通過動物實驗的方式來研究內毒素誘導的心肌損傷時EPO及EPOR的表達水平有著非常重要的現實意義。

研究結果顯示，在腹注LPS后，LPS組大鼠心肌細胞EPO及EPOR濃度明顯高于對照組，表明內毒素誘導大鼠心肌損傷時存在EPO及EPOR高表達，提示體內感染可能是 EPO 及其受體生成的主要刺激因素，分析其原因可能是急性感染導致心肌細胞受損，EPO及EPOR濃度速度上升，使EPO及EPOR調控系統失活，從而使EPO對心臟的保護作用減弱，這為外源性EPO在膿毒癥的心臟保護中的應用提供了可行性。

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（收稿日期：2013-04-11）