浙江省急性腹瀉患兒中腸道病毒檢測分析研究

[摘要] 目的 探討浙江省急性腹瀉患兒的常見病毒組成。 方法 采集5歲以下（≤5歲）急性腹瀉患兒的811份糞便標本，采用ELISA方法檢測A組輪狀病毒（RV），應用多重PCR方法同時檢測B/C組RV、諾如病毒（NoV）、札如病毒（SaV）、腸道腺病毒（AdV）、星狀病毒（AstV），并利用RT-PCR對RV的陽性標本進行G、P分型。結果 811份糞便樣本中，RV、NoV、SaV、AdV 及AstV總的陽性比例分別為25.52%、18.37%、4.44%、2.71%和1.23%；65份（8.01%）混合感染標本中以RV和NoV混合感染所占比例最大（56.92%）； 116份RV的G/P分型中，G3型（37.93%）、G1型（32.75%）和P[8]型（57.76%）是RV的優勢型別，且G3/P[8]（27.59%）是混合感染最主要的組合。結論 浙江省五種常見腹瀉病毒及其混合感染的流行狀況，為臨床治療和疾病監測提供參考價值。

[關鍵詞] 腸道病毒；急性腹瀉；混合感染

[中圖分類號] R725.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）12-0109-05

急性腹瀉是世界范圍內的一個不容忽略的公共衛生問題，在發展中國家，每年共有兩百萬人的死亡與急性腹瀉有關，其中主要是嬰幼兒[1]。隨著抗生素的廣泛應用，加之人們衛生習慣的改善，細菌性腹瀉和寄生蟲性腹瀉感染已有所降低[2]，但是病毒性腹瀉沒有得到有效的控制。輪狀病毒（Rotavirus，RV）、諾如病毒（Norovirus，NoV）、札如病毒（Sapovirus，SaV）、腸道腺病毒（Adenovirus，AdV）、星狀病毒（Astrovirus，AstV）是引起嬰幼兒病毒性腹瀉最主要的五種病原[3]。本研究的目的是了解浙江省5歲以下門診腹瀉患兒中五種常見病毒以及混合感染的分布情況，為我國的病毒性腹瀉的防控工作提供有價值的流行病學和臨床治療的數據支持。

1 材料與方法

1.1資料來源

本研究選取浙江省5家醫院作為監測哨點（浙江大學醫學院附屬第一醫院、浙江大學醫學院附屬兒童醫院、浙江大學醫學院附屬第一醫院北侖分院、湖州市中心醫院和浙江中醫藥大學附屬第一醫院）。隨機收集2010年1～12月期間5家哨點醫院門診病例中5歲以下（含5歲）急性腹瀉患兒的糞便標本811份。標本采集對象均符合每日排便3次或以上，且大便性狀有改變（呈水樣便、稀便）。每個患者只采集一份糞便標本，標本采集時間覆蓋全年各月，每周均有采集；在進行核酸提取之前，所有標本都儲存在-80℃。

1.2核酸的提取

將糞便標本在標本處理液（PBS液）中按1：10比例稀釋后，再以8 000轉/min離心5 min，最后留取上清液于-20℃待測。取200～400 μL處理好的糞便標本上清液，使用臺灣Geneaid 公司生產的商品化核酸提取試劑盒（貨號：VR100）對標本上清液進行核酸提取，操作方法詳見試劑盒說明書。

1.3檢測方法

1.3.1 A組輪狀病毒檢測及其G、P基因分型 采用DAKO輪狀病毒ELISA檢測試劑盒檢測糞便上清液中的A組輪狀病毒，操作步驟詳見試劑盒說明書。對A組輪狀病毒陽性的標本進一步采用一個兩步擴增的逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）進行G、P基因分型，方法同以前研究[4]。G基因分型在第一步擴增中使用Beg9 （forward）/End9 （reverse）作為一對引物擴增出一條1 062 bp的基因片段，該片段在第二步擴增體系中作為鑒定G1、G2、G3、G4、G8和 G9型別的模板；P基因分型中第一步擴增中則使用一個引物對-Con3/Con2擴增一條876 bp的基因片段，作為第二步擴增的模板，鑒定P[4]、P[6]、P[8]、P[9]和P[10]。

1.3.2 B/C組輪狀病毒、諾如病毒（GI和GII）、札如病毒、腸道腺病毒、星狀病毒多重PCR檢測 將提取的病毒核酸應用隨機引物（NO： C1181， Promega， USA）合成病毒cDNA，條件為50℃逆轉錄1 h，99℃滅活逆轉錄酶5 min后，然后迅速放入冰內冷卻。然后以合成的cDNA為模板，進行B/C組輪狀病毒、諾如病毒（GI和GII）、札如病毒、星狀病毒和腸道腺病毒的多重PCR檢測。多重PCR在25μL反應體系中進行，包括10×Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，5 U/μLTaq DNA聚合酶0.125 μL，7對病毒特異性引物（表1）（各33 μmol/L，0.2 μL）的混合物，模板核酸（除腸道腺病毒為DNA，其他均為cDNA）2.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為94℃預變性5 min，然后在94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min條件下進行35個循環，最后以72℃終延伸7 min，4℃下終止反應。最后將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4統計學方法

利用SPSS18.0和Excel軟件進行統計學分析，不同組別的患者和不同病毒的感染率等變量之間的差異采用兩獨立樣本t檢驗和χ2檢驗分析，檢驗統計采用95%的可信區間（P = 0.05），P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢測結果

811份標本中， 353份（43.53%）檢出一種或一種以上病毒，其中288份為單病毒感染，占35.51%（288/811），混合感染65份，占8.01%（65/811），總體來看，輪狀病毒是引起兒童腹瀉最主要的病毒，共207份標本檢出，占25.52%（207/811），其次是諾如病毒占18.37%（147/811），札如病毒占4.44%（36/811），腸道腺病毒和星狀病毒檢出率陽性比例較低，分別占2.71%（22/811）和1.23%（10/811）。

單病毒感染中輪狀病毒、諾如病毒、札如病毒、腸道腺病毒與星狀病毒的陽性比例分別是18.4% （149/811）、 12.6% （102/811）、6.5% （23/811）、2.8% （10/811）和0.5% （4/811）。輪狀病毒是混合感染中最常見的病毒（89.23%，58/65），輪狀病毒和諾如病毒是兩兩混合感染中最常見的組合，共37例，占4.6%，其次是輪狀病毒和札如病毒混合感染，共10例（1.2%），其他兩種病毒混合感染情況的陽性比例均小于0.5%。此外，我們還發現3份標本為輪狀病毒、諾如病毒和腸道腺病毒3種病毒同時感染，1份為輪狀病毒、札如病毒和腸道腺病毒混合感染。

圖1 病毒檢測結果分布。

（A） 353例病毒檢測陽性結果分布； （B） 65例混合感染分布

（RV， rotavirus； NoV， norovirus； SaV， sapovirus； AdV， adenovirus； AstV， astrovirus）.

2.2 性別和年齡分布

811例≤5 歲腹瀉患兒中，男547例，女264例，平均年齡（12.76±11.15）個月，年齡范圍1～60月齡（表2）。輪狀病毒感染平均月齡為（10.76±7.19）個月，比諾如病毒平均月齡（13.71±9.61）低（P = 0.009）。輪狀病毒在7～12月齡組患兒中陽性比例最高，與其他年齡組相比，差異有統計學意義（χ2=12.203，P < 0.01），25～60月齡組陽性比例（5.26%）最低；諾如病毒感染發病高峰在13～24月齡組，較其他年齡組高（χ2=8.565，P = 0.003），但是在13～24月齡組無札如病毒檢出；腸道腺病毒和星狀病毒感染全部發生于24月齡組以下兒童；混合感染中2歲以上患兒的陽性比例較2歲以下兒童高（P < 0.01）。見表2。

2.3病毒的基因分型

206份輪狀病毒陽性標本中，均為A組輪狀病毒，未發現B和C組輪狀病毒，A組輪狀病毒標本中的116份做了進一步的G、P基因型鑒定，結果G3型44份（37.93%），G1型38份（32.75%），G4型6份（5.17%），G2型6份（5.17%），G9型5份（4.31%），檢出G1和G3型混合感染1份（0.86%），未確定型別16份（13.79%）；P[8]基因型 67份（57.76%），P[4] 型17份（14.66%）、P[6]型5份（4.31%）、P[10] 型2份（1.72%）和P[9]型1份（0.86%），未確定P基因型24份（20.69%）。見表3。

G、P基因型組合以P[8]G3組合為主，占27.59%（32/116），其次是P[8]G1，占16.38%（19/116），P[4]G1占6.03%，P[8]G4占5.17%。

此外，147份諾如病毒陽性標本包括GII基因型116份（占78.91%），G I基因型29份（占19.73 %），GI和GII型混合感染2份。

3討論

本研究較系統地對我國東南沿海三省門診病例中常見的5種腹瀉病毒及其混合感染情況進行了監測。檢出任一病原陽性標本陽性比例為43.5%，其中輪狀病毒（25.5%）和諾如病毒（18.4%）是導致兒童腹瀉最主要的兩種病毒，札如病毒為4.4%，腸道腺病毒（2.7%）和星狀病毒（1.2%）感染比例相對最低。

A組輪狀病毒是感染急性腹瀉的最主要病原，且經常引起兒童的嚴重腹瀉，輪狀病毒根據不同的抗原和遺傳特性分為A～G共7組，其中A、B、C組與人類感染有關[4]。諾如病毒在流行性和散發性腹瀉中都扮演著重要角色，并且在各年齡組都能引起病毒性腹瀉的發生[5]，但目前為止還沒有能治療諾如病毒性腹瀉的方法。札如病毒能夠在5歲以下兒童病例中引起小規模的流行，但癥狀往往比諾如病毒的輕[6]。近年的研究表明，腸道腺病毒能夠增加免疫力低下人群的腹瀉發病率，并能夠延長患者住院時間[2]。星狀病毒則被證實是引起兒童、老年人以及免疫力低下患者的重要感染病原之一[3]。

我國以5歲以下兒童為基礎的RV腹瀉監測網全年系統監測結果表明，中國門診腹瀉患兒的RV中位陽性比例為29%（范圍：15%～35%）[4]，本次監測結果與之相符，其中A組輪狀病毒是門診腹瀉患兒感染最多的病原。研究表明，輪狀病毒流行毒株在不同年份、不同地區存在差異[4，7]，G1、G2、G3、G4毒株和P[8]為感染人類的主要型別，我國近年來的的優勢毒株為G3型和P[8]型。本次研究G分型結果顯示， G3比例最高，占37.9%，但G1的比例達到了32.75%，接近G3，提示G1的感染和G3同樣重要。近些年，G9型輪狀病毒已經成為世界范圍內一種常見的毒株[2-4，7]，我國5歲以下住院兒童G9的感染率為4%[4]，而本次門診病例的監測中發現G9的感染率達到4.3%，提示在我國，無論是住院還是門診患兒G9型的監測都有重要的意義。P 分型中，P [8] 型最多，占57.8%，其他型別比例較少，尤其值得注意的是，我們還分離到2株P[10]基因型標本，占1.7%（2/116），這是該地區的首次報道。之前的文獻報道各種G、P 型組合的分布具有較大的差異[4，8]，本次監測中以G3P [8]組合為主（27.59%），其次是G1P [8] （16.4%），G1P [4] （6.0%） 和G4P [8] （5.2%），應該提出的是，G2P[4]作為世界上四種常見的組合之一[9]。在本研究中僅占2.6%。另外，近年來一些國家和地區出現了一些既往少見型別如G5、G6、G8、G10和G12以及一些不常見的組合[10]。這些輪狀病毒流行株的不斷變化意味著輪狀病毒抗原之間存在廣泛的變異性，提示持續不斷地監測輪狀病毒的分子流行病學變化能夠為研究輪狀病毒地區間的傳播關系、闡明毒株的地理分布提供科學依據。

據全國病毒性腹瀉監測網絡對我國11個省份5歲以下腹瀉兒童的監測，我國2007年諾如病毒陽性比例大約為15%，和往年基本一致。東南沿海地區為諾如病毒高發區[11，12]，曾玫等2010年對我國五所城市的醫院門診腹瀉患兒連續一年的流行病學調查，結果我國東南部城市上海、杭州和廣州的門診病例中諾如病毒陽性比例分別為14.9%、20.0%和17.9%，三個地區總陽性比例為17.6%（494/2804）[13，14]。我們的結果（陽性比例為18.4%）與以上的研究結果接近，但高于國內住院患兒諾如病毒感染率（大約8.9%～10.3%）[11-13]；和一些發達國家相比，我們的結果偏高，如美國7.4%和日本13.2%[15，16]。可能與以下因素有關：首先，諾如病毒主要經糞-口傳播，通過污染的水源和食物、空氣以及人與人的直接接觸傳播，甚至有報道廣泛污染的環境表面也可能在諾如病毒爆發中起著重要的作用[13-15]，作為一個發展中國家，我國的衛生條件較發達國家差距較大，為諾如病毒的傳播提供了有利的條件。另外，諾如病毒常在人口聚集區引起集體暴發，而據統計，我國東南部的人口密度達到了362.8人/平方公里（人口基數來源于2008年底），遠遠高于其他國家和地區，成為諾如病毒感染的另一有利條件。

諾如病毒GII基因型比GI 型更為流行[14]，本研究中GII基因型占絕大部分78.9%，GI 型僅占19.7%，與Blanton LH等研究結果較吻合[17]，他們利用RT-PCR方法進行諾如病毒分型，結果GII基因型占79%，GI 型占19%。與諾如病毒研究相比，國內關于札如病毒系統的流行病學研究比較少，針對門診病例的研究更是缺乏。札如病毒感染在世界范圍內均有分布，感染率為0.3%～9.3%[18，19]。我國蘭州地區2003～2007年住院患兒急性腹瀉患兒陽性率為1.13%，而中國疾控中心對我國九省市住院患兒札如病毒流行情況的調查結果顯示，我國急性腹瀉患兒札如病毒總陽性比例僅為0.9%，明顯低于國外研究。我們的研究結果（4.4%）與之較為接近，但比國內住院患兒感染率高，并且也超過腸道腺病毒（2.71%）與星狀病毒（1.23%）成為我國東南沿海門診病例中第三位的重要病毒。可能是因為札如病毒引起的腹瀉癥狀輕，且有自限性[20，21]。腺病毒和星狀病毒則易引起重型腹瀉從而導致患兒住院治療[2， 21]。我國應該加強以門診或社區為單位的監測，以求能更合理地反映我國札如病毒的疾病負擔。

本次監測結果中混合感染情況復雜，多達9種組合，陽性比例達到8.0%。值得注意的是，我們發現了4份（0.5%，4/811）標本為3種病毒混合感染，其中3份為輪狀病毒、諾如病毒和腸道腺病毒混合感染，1份為輪狀病毒、札如病毒和腸道腺病毒感染。近年來，3種病毒同時感染的現象在其他不同的研究中也不斷地被報道出來，而且組合的種類越來越多[4， 22]。雖然病毒之間的相互組合對疾病嚴重程度是否有增強作用尚存爭議，但是混合感染的存在已經是一個不容忽視的問題[23]。以上結果告訴我們一方面要加強病毒性腹瀉中混合感染情況的監測，另一方面也要重視開展涉及病原范圍更廣（包括細菌、病毒、甚至寄生蟲）的流行病學以及臨床病理學研究，以更好地了解我國急性感染性腹瀉的本地資料。

五種病毒及其混合感染均無性別差異。病毒性腹瀉高發年齡是7～24月齡，2歲以下患兒占95.5%（337/353）。國內外研究提示2歲以下兒童是輪狀病毒和諾如病毒的易感人群[4，23，24]，本研究中輪狀病毒以7～24月齡感染率（21.1%）最高，高于1～6月齡（15.0%）和25～60月齡（5.3%），該結論一方面支持了母體抗體對輪狀病毒感染具有保護作用的觀點，另一方面也提示2周歲以下的低齡兒童應為輪狀病毒疫苗的施治的重點人群。通過比較發現，輪狀病毒感染平均月齡為（10.76±7.19）個月，小于諾如病毒平均月齡（13.71±9.61）個月（P = 0.009），說明兒童中諾如病毒感染年齡比輪狀病毒感染年齡偏大[20]。既往的研究顯示札如病毒腹瀉發病年齡主要在5歲以下[21]，本次研究中未發現7～12月齡患兒，其他各年齡組之間陽性比例無統計學差異。腸道腺病毒感染全部發生在2歲以下的兒童中，一方面，該結果可能是受到了2歲以上有限的監測病例（僅有57例，占7.0%）的影響，從而與真實情況存在偏差，且星狀病毒感染也全部發生在2歲以下的兒童中。2歲以上兒童較2歲以下兒童混合感染率高（P < 0.001），能否說明兒童中高年齡組易發混合感染有待進一步研究驗證。

總之，這是第一次在我國東南地區開展的多中心的同時利用ELISA和多重PCR技術對門診病例中病毒性腹瀉患兒的病原學監測，不僅清晰地說明了我國東南地區五種常見腹瀉病毒及其混合感染的流行狀況，而且科學地闡明我國病毒性腹瀉的流行規律、發病狀況和疾病負擔，為臨床進一步研究提供了必需的本地資料。為了更加準確地了解我國病毒性腹瀉的疾病負擔以及有針對性地開發、改進疫苗，長期和廣泛的監測研究是十分必要的。

[參考文獻]

[1] Park S H，Kim E J，Oh S A，et al. Viral agents associated with acute gastroenteritis in Seoul，Korea[J]. Clin Lab，2011，57（1-2）：59-65.

[2] Clark B，Mckendrick M. A review of viral gastroenteritis[J]. Curr Opin Infect Dis， 2004， 17（5）：461-469.

[3] Dennehy P H. Viral gastroenteritis in children[J]. Pediatr Infect Dis J， 2011， 30（1）：63-64.

[4] Duan ZJ， Liu N， Yang SH， et al. Hospital-based surveillance of rotavirus diarrhea in the People's Republic of China， August 2003-July 2007[J]. J Infect Dis， 2009， 200（Suppl 1）：S167-S173.

[5] Rimoldi S G，Stefani F，Pagani C，et al. Epidemiological and clinical characteristics of pediatric gastroenteritis associated with new viral agents[J]. ArchVirol，2011，156（9）：1583-1589.

[6] Hansman GS，Saito H，Shibata C， et al. Outbreak of gastroenteritis due to sapovirus[J]. J Clin Microbiol，2007，45（4）：1347-1349.

[7] Iturriza-Gomara M， Dallman T， Banyai K， et al. Rotavirus genotypes co-circulating in Europe between 2006 and 2009 as determined by EuroRotaNet， a pan-European collaborative strain surveillance network[J]. Epidemiol Infect，2011，139（6）：895-909.

[8] Esona MD，Armah GE，Steele AD. Rotavirus VP4 and VP7 genotypes circulating in Cameroon： Identification of unusual types[J]. J Infect Dis， 2010， 202（Suppl）：S205-S211.

[9] Dey S K，Hayakawa Y，Rahman M， et al. G2 strain of rotavirus among infants and children， Bangladesh[J]. Emerg Infect Dis，2009，15（1）：91-94.

[10] Armah G E，Hoshino Y，Santos N，et al. The global spread of rotavirus G10 strains： Detection in Ghanaian children hospitalized with diarrhea[J]. J Infect Dis，2010，202（Suppl）：S231-S238.

[11] Guo L，Song J，Xu X，et al. Genetic analysis of norovirus in children affected with acute gastroenteritis in Beijing，2004-2007[J]. J Clin Virol，2009，44（1）：94-98.

[12] 徐友富，童貽剛，茹志濤，等. 諾如病毒感染國內外研究概況[J]. 中國衛生檢驗雜志， 2008，18（5）：949-951.

[13] 曾玫，陳潔，龔四堂，等. 我國五所城市兒童醫院諾如病毒和輪狀病毒腹瀉的流行病學監測[J]. 中華兒科雜志， 2010， 48（8）：564-570.

[14] Jin M，Xie HP，Duan ZJ，et al. Emergence of the GII4/2006b variant and recombinant noroviruses in China[J]. J Med Virol， 2008， 80（11）：1997-2004.

[15] Hall AJ， RosenthalM， Gregoricus N， et al. Incidence of acute gastroenteritis and role of norovirus， Georgia， USA， 2004-2005[J]. Emerg Infect Dis， 2011， 17（8）：1381-1388.

[16] Nakanishi K，Tsugawa T，Honma S，et al. Detection of enteric viruses in rectal swabs from children with acute gastroenteritis attending the pediatric outpatient clinics in Sapporo， Japan[J]. J Clin Virol，2009，46（1）：94-97.

[17] Blanton LH，Adams SM，Beard RS，et al. Molecular and epidemiologic trends of caliciviruses associated with outbreaks of acute gastroenteritis in the United States， 2000-2004[J]. J Infect Dis，2006，193（3）：413-421.

[18] Sdiri-Loulizi K，Hassine M，Gharbi-Khelifi H，et al. Molecular detection of genogroup I sapovirus in Tunisian children suffering from acute gastroenteritis[J]. Virus Genes， 2011， 43（1）：6-12.

[19] Malasao R，Maneekarn N，Khamrin P，et al. Genetic diversity of norovirus， sapovirus， and astrovirus isolated from children hospitalized with acute gastroenteritis in Chiang Mai， Thailand[J]. J Med Virol，2008，80（10）：1749-1755.

[20] Eckardt AJ，Baumgart DC. Viral gastroenteritis in adults[J]. Recent Pat Antiinfect Drug Discov，2011，6（1）：54-63.

[21] Tran A，Talmud D，Lejeune B，et al. Prevalence of rotavirus，adenovirus，norovirus，and astrovirus infections and coinfections among hospitalized children in northern France[J]. J Clin Microbiol，2010，48（5）：1943-1946.

[22] Li CS，Chan PK， Tang JW. Prevalence of diarrhea viruses in hospitalized children in Hong Kong in 2008[J]. J Med Virol，2009，81（11）：1903-1911.

[23] Kittigul L，Pombubpa K，Taweekate Y，et al. Molecular characterization of rotaviruses， noroviruses， sapovirus， and adenoviruses in patients with acute gastroenteritis in Thailand[J]. J Med Virol，2009，81（2）：345-353.

[24] 葉新華，金玉，方肇寅，等. 蘭州地區2003-2007年急性腹瀉住院患兒中札如病毒感染情況研究[J]. 中華流行病學雜志，2008，29（8）：843-844.

（收稿日期：2013-03-18）