抗癲一號(hào)對(duì)癲癇大鼠自由基代謝及海馬神經(jīng)元的影響

[摘要] 目的 探討抗癲一號(hào)對(duì)慢性致癇大鼠自由基含量及海馬神經(jīng)元的影響。 方法 腹腔注射戊四唑（PTZ）造成慢性癲癇大鼠動(dòng)物模型，化學(xué)比色法測(cè)定其自由基含量，HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)元變化。 結(jié)果 抗癲一號(hào)可減少癲癇大鼠血清內(nèi)自由基含量，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；可增加海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)目，恢復(fù)神經(jīng)元形態(tài)及結(jié)構(gòu)。 結(jié)論 抗癲一號(hào)通過(guò)增加抗氧化酶活性來(lái)阻止PTZ點(diǎn)燃后所產(chǎn)生的自由基對(duì)神經(jīng)元的損害，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 抗癲一號(hào)；癲癇；戊四唑；自由基；神經(jīng)元

[中圖分類號(hào)] R742.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）11-0020-02

癲癇是以腦部神經(jīng)元異常過(guò)度放電所致的突然、反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。隨著近年來(lái)自由基與癲癇腦損傷之間關(guān)系的研究逐漸深入，自由基在癲癇中的作用越來(lái)越受到重視。抗癲一號(hào)由石菖蒲、郁金、柴胡等中藥組成，具有豁痰熄風(fēng)、活血開竅、補(bǔ)腎疏肝、寧心益智的功效。本實(shí)驗(yàn)擬采用抗癲一號(hào)治療戊四唑誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，觀察其對(duì)癲癇大鼠自由基及神經(jīng)元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠，體重180～220 g，雌雄各半，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK-（軍）2007-005）。

1.1.2 藥品 抗癲一號(hào)由沈陽(yáng)市第六人民醫(yī)院提供，含10.12 g生藥/g，批號(hào)：101018；苯妥英鈉片，東北制藥總廠生產(chǎn)，批號(hào)：200909102；癲癇寧片，昆明中藥廠有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：100610。

1.1.3 主要試劑與儀器 戊四唑（PTZ），美國(guó)Sigma公司；多聚甲醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：F20091203；烏來(lái)糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：T20090811；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20110112；丙二醛（MDA）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)：20110114；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；ELX800酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PTZ大鼠點(diǎn)燃模型 取體重180～220 g Wistar大鼠150只，雌雄各半，隔日腹腔注射以生理鹽水新鮮配制的濃度為1%的PTZ溶液，即為40 mg/kg的亞驚厥劑量，并在注射PTZ后觀察動(dòng)物的行為變化，記錄發(fā)作潛伏期、發(fā)作分級(jí)和發(fā)作持續(xù)時(shí)間。發(fā)作分級(jí)按照Racine′s[1]的6級(jí)分級(jí)法：0級(jí)：無(wú)驚厥；1級(jí)：點(diǎn)頭或頭部抽搐；2級(jí)：全身肌陣攣；3級(jí)：頭部抽搐加前肢陣攣；4級(jí)：陣攣驚厥加后肢站立；5級(jí)：跌倒；6級(jí)：全身強(qiáng)直-陣攣驚厥。連續(xù)觀察28 d，凡連續(xù)5次出現(xiàn)2級(jí)或以上記錄的大鼠，即為點(diǎn)燃模型大鼠。停藥1周后，再次用同樣方法測(cè)試，如仍保持在2級(jí)以上發(fā)作，則視為點(diǎn)燃成功。

1.2.2 分組及給藥 取模型成功大鼠，分為6組，每組16只，雌雄各半，另取16只大鼠為空白對(duì)照組；模型對(duì)照組（兩組分別給予等體積的蒸餾水）；抗癲一號(hào)低劑量組（8.11 g生藥/kg）、中劑量組（16.22 g生藥/kg）、高劑量組（32.44 g生藥/kg）；癲癇寧片組（1.705 g/kg）；苯妥英鈉片組（0.027 g/kg），給藥容積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)給藥30 d。

1.2.3 對(duì)癲癇大鼠血清中SOD、MDA含量的影響 每組取8只大鼠，雌雄各半，采用化學(xué)比色法測(cè)定大鼠血清中SOD 活性及MDA 含量，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 對(duì)癲癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的影響 各組取8只大鼠，雌雄各半，麻醉后，開胸暴露心臟，0.9%生理鹽水灌注沖洗后灌注4%多聚甲醛，見四肢強(qiáng)直后斷頭取出腦組織，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋，HE染色觀察癲癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行檢驗(yàn)分析。均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，評(píng)價(jià)整體性差異，組間均數(shù)采用One-Way ANOVA方法分析，并結(jié)合LSD分析方法進(jìn)行組間比較。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 抗癲一號(hào)對(duì)PTZ癲癇大鼠模型血清中SOD、MDA含量影響

藥物干預(yù)組可降低癲癇大鼠血清中MDA含量，增加SOD含量，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P <0.01）。見表1。

2.2 抗癲一號(hào)對(duì)PTZ癲癇大鼠模型海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響

鏡下可見PTZ癲癇大鼠模型海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)改變，且細(xì)胞層次紊亂，細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)著色不均勻，組織間水腫，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；各給藥組可見海馬神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)有所恢復(fù)，與模型組比較，細(xì)胞數(shù)目增加、大小較均勻、形態(tài)結(jié)構(gòu)較清晰，核固縮變形和組織水腫現(xiàn)象有所減輕，偶見散在的炎性細(xì)胞，見圖1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTZ點(diǎn)燃癲癇大鼠模型可產(chǎn)生大量自由基，抗癲一號(hào)具有潛在的抗氧化作用，降低MDA含量，增加SOD水平；且可抑制由自由基產(chǎn)生所帶來(lái)的海馬神經(jīng)元的損傷。

有研究表明，癲癇發(fā)作可使體內(nèi)自由基增多，并損害周圍組織。因此，學(xué)者們假設(shè)可清除癲癇發(fā)病過(guò)程中自由基的物質(zhì)將成為具有神經(jīng)保護(hù)作用的新型抗癲癇藥物，無(wú)獨(dú)有偶，近期的大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也恰恰證明了具有抗氧化作用的物質(zhì)在治療癲癇方面的有效性[2]。Frantaeva[3]等對(duì)杏仁核點(diǎn)燃大鼠癲癇發(fā)作后自由基產(chǎn)生情況及其對(duì)神經(jīng)元的損害研究中發(fā)現(xiàn)，自發(fā)點(diǎn)燃大鼠模型的海馬區(qū)自由基產(chǎn)生增加，神經(jīng)元細(xì)胞減少，給予抗氧化產(chǎn)物（維生素E及谷胱甘肽）則可抑制自由基的產(chǎn)生及海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的死亡；Ilhan等研究發(fā)現(xiàn)[4，5]，抗氧化劑可顯著抑制癲癇大鼠的發(fā)作，減少自由基的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)均提示自由基參與了癲癇發(fā)作及其病理過(guò)程。此外，電生理學(xué)研究也證明了通過(guò)短暫性增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)減少抑制性神經(jīng)遞質(zhì)可促使大鼠海馬、紋狀體的自由基-過(guò)氧化氫復(fù)合物的超興奮性。

在大量的癲癇動(dòng)物模型中，PTZ點(diǎn)燃后可產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞膜磷脂酶，蛋白酶和核酸酶的激活。最明顯的改變是細(xì)胞膜磷脂酶的代謝可導(dǎo)致游離脂肪酸、甘油二酯、類花生酸、脂類過(guò)氧化物及自由基的釋放[6-7]。生理情況下，受到自由基損害的組織可通過(guò)抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行防御。SOD為重要的抗氧化酶之一，與自由基發(fā)生反應(yīng)后可阻止組織損害。MDA則由自由基攻擊所產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物分解的終產(chǎn)物。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持PTZ點(diǎn)燃癲癇發(fā)作的同時(shí)伴隨自由基增多的假設(shè)。本實(shí)驗(yàn)中，模型組SOD活性降低，MDA含量增加。由此可推測(cè)抗氧化酶活性的改變可增加脂質(zhì)過(guò)氧化物。抗癲一號(hào)則可降低MDA含量，增加SOD活性，與文獻(xiàn)結(jié)論一致[8，9]。這些結(jié)果提示抗癲一號(hào)通過(guò)增加抗氧化酶活性來(lái)阻止PTZ點(diǎn)燃后所產(chǎn)生的自由基對(duì)組織的損害。

癲癇發(fā)作時(shí)腦內(nèi)的自由基含量增加，而增加的自由基通過(guò)促使蛋白功能喪失，干預(yù)細(xì)胞氧化還原反應(yīng)后的細(xì)胞周期循環(huán)等多方面作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，死亡的神經(jīng)元可再次增加腦內(nèi)自由基的含量，由此形成惡性循環(huán)。因此抑制自由基的產(chǎn)生可減少神經(jīng)元的死亡，反之，增加神經(jīng)元的生存率亦可減少自由基對(duì)腦內(nèi)組織的損害。研究表明，腦內(nèi)海馬區(qū)與意識(shí)及控制反饋有關(guān)[10]，并對(duì)產(chǎn)生的自由基特別敏感，所以可用來(lái)進(jìn)行癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元損傷狀況的觀察。本研究結(jié)果表明，抗癲一號(hào)可增加海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量，恢復(fù)神經(jīng)元形態(tài)及結(jié)構(gòu)，減輕核固縮及水腫，充分證實(shí)了抗癲一號(hào)在阻止PTZ點(diǎn)燃后產(chǎn)生的自由基損害上神經(jīng)保護(hù)的角色。

綜上所述，阻止癲癇發(fā)作期間自由基的產(chǎn)生可成為治療癲癇的另一靶目標(biāo)，且對(duì)癲癇病人給予抗氧化治療具有重要意義。當(dāng)然，抗氧化劑治療的臨床研究更是十分必要的。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 賈冬，齊越，夏素霞，等. 癲癇清片對(duì)慢性致癇大鼠海馬區(qū)氨基酸含量的影響[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2009，36（2）：303-304.

[2] Kabuto H，Yokoi I，Ogawa N. Melatonin inhibits iron-induced epileptic discharges in rats by suppressing peroxidation[J]. Epilepsia，1998，39（3）：237-243.

[3] Frantseva MV，Perez Velazquez JL，Tsoraklidis G，et al. Oxidative stress is involved in seizure-induced neurodegeneration in the kindling model of epilepsy[J]. Neurosci，2000，97（3）：431-435.

[4] Ilhan A，Iraz M，Gurel A，et al. Caffeic acid phenethyl ester exerts a neuroprotective effect on CNS against pentylenetetrazole-induced seizures in mice[J]. Neurochem Res，2004，29（12）：2287-2292.

[5] Ilhan A，Aladag MA，Kocer A，et al. Erdosteine ameliorates PTZ-induced oxidative stress in mice seizure model[J]. Brain Res Bulletin，2005，65（6）：495-499.

[6] Obay BD，Tasdemir E，Tümer C，et al. Dose dependent effects of ghrelin on pentylenetetrazole-induced oxidative stress in a rat seizure model[J]. Peptides，2008，29（3）：448-455.

[7] Silva MIG，Silva MAG，Neto MRA，et al. Effects of isopulegol on pentylenetetrazol-induced convulsions in mice： possible involvement of GABAergic system and antioxidant activity[J]. Fitoterapia，2009，80（8）：506-513.

[8] Hamed SA，Abdellah MM，El-Melegy，N. Blood levels of trace elements，electrolytes，and oxidative stress/antioxidant systems in epileptic patients[J]. J Pharmacol Sci，2004，96（4）：465-473.

[9] Thomas K，Chang H，Abott FS. Oxidative stress as a mechanism of valproic acid-associated hepatotoxicity[J]. Drug Metab Rev，2006，38（4）：627-639.

[10] Merrill DA，Chiba AA，Tuszynski MH. Conservation of neuronal number and size in the entorhinal cortex of behaviorally characterized aged rats[J]. J Comp Neuro，2001，438（4）：445-456.

（收稿日期：2013-02-20）