中藥秦艽提取物抑制人晶狀體上皮細胞遷移的研究

[摘要] 目的 為了驗證中藥秦艽提取物抑制培養的人晶狀體上皮細胞遷移的作用，尋找防治后發障的新藥物。方法 晶狀體上皮細胞長成單層后，分別加入1000、500、250、125和62.5 mg/L的秦艽提取物，培養24 h，觀察細胞毒性，確定藥物的半數毒性濃度。細胞用1 mL加樣器槍頭劃痕，分別加入100、10、1、0.1 mg/L秦艽提取物，培養24 h。對細胞進行照像，測出實驗前后的細胞痕的寬度，計算出細胞遷移距離，測定藥物的半數有效濃度及計算秦艽提取物的治療指數。 結果 秦艽提取物半數細胞毒性濃度為421.7 mg/L。以秦艽提取物濃度對數與遷移距離做回歸分析，結果顯示相關系數為-0.966，有顯著性差異（P = 0.034）。秦艽提取物的半數有效治療濃度為0.38 mg/L。秦艽提取物治療指數為1110。 結論 秦艽提取物可抑制晶狀體上皮細胞的遷移，具有低毒、高效的特點，有望成為防治后發障的有效藥物

[關鍵詞] 秦艽提取物；晶狀體上皮細胞；遷移；后發障

[中圖分類號] R776.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）24-0001-03

后發障是白內障手術后二次致盲的主要原因，雖然Nd：YAG激光可治療，但存在多種并發癥，如黃斑囊樣水腫、視網膜脫離和眼壓升高等，因此，研究藥物防治后發障具有實際意義?？勾x藥雖可抑制后發障的發生，但其毒副作用較多。研究發現，中藥中有些具有抗炎作用的藥物可抑制細胞的增殖，但對抑制細胞遷移方面的報道較少。本文中，我們發現秦艽提取物可抑制培養的人晶狀體上皮細胞的遷移，有望成為防治后發障的有效藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

秦艽提取物。取秦艽，加8倍量水煎煮三次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，濾液在50℃～60℃減壓濃縮至相對密度為1.11～1.15，加乙醇使含醇量達80%，靜置12 h，濾過，回收乙醇至無醇味，加水稀釋至與藥材量之比為2∶1，靜置12 h，濾過，濾液加到已處理好的SP70大孔吸附樹脂柱，樹脂與藥材量之比為1∶1.5，依次用5%、40%乙醇溶液（5倍柱體積，2倍柱體積/h）梯度洗脫，收集40%乙醇洗脫液，減壓濃縮成稠膏，稠膏干燥，即得。

1.2 細胞和細胞培養液

人晶狀體上皮細胞系（SRA 01/04）由本單位張煒研究員惠贈。F12/DMEM營養液（Hyclone）；胎牛血清、Hepes液、胰蛋白酶/EDTA和D-Hanks液（Gibco）；L-Glu（Sigma）；青霉素、鏈霉素（華北制藥）。配制200 mL細胞培養液：F12/DMEM營養液165～185 mL，血清10～30 mL，雙抗（青霉素2萬U/mL，鏈霉素20 mg/mL）1 mL，L-Glu（200 mmol/L）1 mL，Hepes液2.5 mL。再加入胎牛血清，分別配成含血清為5%、10%和15%的細胞培養液備用。

1.3 人晶狀體上皮細胞的培養

使用15%血清培養液進行傳代培養，加D-Hanks液沖洗，胰蛋白酶/EDTA（0.25%胰酶、0.03%EDTA）作用2 min，吸出消化液，加入營養液，將細胞加入96孔培養板中繼續培養。

1.4 藥物細胞毒性的測定

96孔培養板的細胞長成單層后，加D-Hanks液沖洗，分別加入1000、500、250、125和62.5 mg/L的秦艽提取物的營養液，培養24 h，觀察細胞毒性，確定藥物的半數毒性濃度（IC50）。

1.5 比較不同濃度血清對細胞遷移的影響

96孔板中細胞長滿后，用1 mL加樣器槍頭劃痕，分別加入10%和5%的血清培養液，培養24 h，對細胞進行照像，測出實驗前后的細胞痕的寬度，計算出細胞遷移距離。

1.6 秦艽提取物對細胞遷移的作用

96孔板中細胞長滿后，用1 mL加樣器槍頭劃痕，分別加入用含5%血清的營養液配制濃度為100、10、1、0.1 mg/L秦艽提取物，培養24 h，對細胞進行照像，測出實驗前后的細胞痕的寬度，計算出細胞遷移距離，計算秦艽提取物的半數有效濃度（EC50）和治療指數（TI）。

1.7 統計學處理

采用SPSS16統計學軟件進行統計處理，血清對細胞遷移距離影響采用t檢驗，藥物濃度與遷移的關系采用回歸分析。

2 結果

2.1 秦艽提取物的毒性

不同濃度的秦艽提取物對細胞的毒性見表1，藥物毒性隨濃度的減少而降低，半數細胞毒性濃度（IC50）為421.7 mg/L。

2.2血清濃度對細胞遷移的影響

細胞培養液中不同血清濃度對晶狀體上皮細胞遷移有一定的影響，24 h后，10%血清培養液細胞的遷移距離為（0.84±0.12），5%血清培養液細胞的遷移距離為（0.59±0.06），兩者有顯著性差異（P = 0.024），血清濃度越高，細胞遷移的距離越大。

2.3 秦艽提取物對細胞遷移的作用

加入藥物后24 h，以5%血清實驗，秦艽提取物在藥物濃度為0、0.1、1、10和100 mg/L時，細胞遷移距離分別為0.61、0.53、0.45、0.14和0.06（圖1、2和3）。以秦艽提取物濃度對數與遷移距離做回歸分析，結果顯示相關系數為 -0.966，有顯著性差異（P = 0.034）。通過計算得出，秦艽提取物的半數有效治療濃度（EC50）為0.38 mg/L。

2.4 藥物的治療指數（TI）

秦艽提取物治療指數（TI）為半數毒性濃度（IC50）/半數有效濃度，結果為1110。

3 討論

晶狀體上皮細胞是晶狀體中唯一細胞，是維持晶狀體功能的主要部分，它與囊膜一起共同保護晶狀體。正常情況下，晶狀體上皮細胞不斷向晶狀體內部遷移，并轉化為纖維細胞，形成晶狀體皮質和晶狀體核。白內障術后，由于細胞微環境的變化，使細胞產生增殖和遷移的傾向，結果造成后發性白內障的發生。

晶狀體上皮細胞從解剖位置上可分為兩種：赤道部細胞和前囊細胞。這兩種細胞在后發性白內障的發生過程中起不同的作用[1]，赤道部細胞具有遷移能力，可沿后囊膜與人工晶體之間空隙遷移到后囊膜的中心部位。如果空隙狹窄，這些細胞較平坦；如果空隙較寬，細胞變成球形結構——珍珠樣小體；如果空隙更寬，珍珠樣小體可形成多層或巨型結構。前囊細胞在撕囊后保留下來，表現出移行的能力，但更具有向間質細胞轉化的能力，引起膠原的吸附和沉積，導致前囊膜皺縮，造成囊袋閉鎖。

后發障是白內障手術的主要后遺癥，特別是兒童的后發障發病率還較高，為了減少后發障的發生，減輕患者的痛苦，研究防治后發障藥物很有必要。

秦艽是龍膽科多年生草本植物，是治風濕關節痛、結核病潮熱、黃疸等癥的主藥之一，《神農本草經》記載，“秦艽主寒熱邪氣，寒濕風痹，肢節痛、下水、利小便”。實驗研究顯示，秦艽提取物不但具有抗炎的作用[2]，而且還具有抗腫瘤[3]、抗病毒[4]和抗細菌[5]的作用。

我們的實驗發現，秦艽提取物對人晶狀體上皮細胞遷移有抑制作用，呈劑量相關性。另外血清濃度高，可促進細胞遷移，我們選擇5%的血清營養液進行實驗。龍膽苦苷是秦艽提取物的主要成分，占總量的50%以上，但我們的研究顯示，龍膽苦苷對人晶狀體上皮細胞的遷移無抑制作用，推測秦艽提取物抑制人晶狀體上皮細胞遷移的作用來源于藥物的其他成分。秦艽提取物抑制晶狀體上皮細胞的遷移的機制可能與影響細胞黏附分子功能有關[6]。

防治后發障的藥物只有進入眼內并作用于晶狀體上皮細胞才能起作用，可在手術中將藥物注射到前房，晶狀體上皮細胞遷移可被前房內注射的bFGF反義寡核苷酸抑制[7]，也可將藥物包裹在人工晶體上。Eibl等[8]將烷基磷酸膽堿包裹人工晶體植入眼內，可顯著抑制晶狀體上皮細胞遷移，減少后發障的發生。

綜上，秦艽提取物毒性小，作用強，治療指數高，如用于臨床，可為防治后發障的發生提供新的藥物。

[參考文獻]

[1] Menapace RM. Prevention of Posterior Capsule Opacification[M]. In Kohnen T and Koch DD. Cataract and Refractive Surgery，Heidelberg，Springer，2005：101-122.

[2] Jia N，Li Y，Wu Y，et al. Comparison of the anti-inflammatory and analgesic effects of Gentiana macrophylla Pall. and Gentiana straminea Maxim，and identification of their active constituents[J]. J of Ethno-pharmacology，2012，144（3）：638-645.

[3] 汪海英，袁冬萍，李福安，等. 秦艽總苷對人肝癌細胞等幾種腫瘤細胞的體外作用[J]. 青海醫學院學報，2009，30（3）：173-176.

[4] 李永平，李向陽，王樹林，等. 秦艽提取物抗病毒的藥效學實驗研究[J]. 時珍國醫國藥，2010，21（9）：2267-2269.

[5] 張永貴，楊鳳琴，袁本香，等. 秦艽提取物體外抑菌實驗研究[J]. 包頭醫學，2011，35（2）：85-86.

[6] Choi B， Kim J， Lee E，et al. Synthesized pyridine compound derivatives decreased TNF alpha and adhesion molecules and ameliorated HSV-induced inflammation in a mouse model[J]. Eur J Pharmacol，2011，657（1）：167-172.

[7] 劉宏偉，彭淑玲，周毅等. bFGF反義寡核苷酸抑制大鼠實驗性晶狀體損傷后晶狀體上皮細胞的增殖和遷移[J]. 眼視光學雜志，2002，4（1）：14-17.

[8] Eibl KH，Wertheimer C，Kernt M，et al. Alkylphosphocholines for intraocular lens coating[J]. J Cataract Refract Surg，2013，39（3）：438-445.

（收稿日期：2013-05-21）