蘆筍中多酚氧化酶（PPO）酶學特性研究

摘 要：文章采用分光光度法，以鄰苯二酚為底物，研究了蘆筍組織中多酚氧化酶（PPO）的活性，以及最適底物濃度，最適pH值，最適溫度，熱穩定性和檸檬酸、L-半胱氨酸、抗壞血酸、亞硫酸鈉等抑制劑對PPO的抑制效果。結果表明：其最適底物濃度為0.2mol/L；最適pH范圍為6.6-7.0，pH在6以下可抑制酶活；最適溫度為40℃，80-90℃熱處理1-2min可使酶失活；抑制劑抑制效果由強到弱依次為：抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸鈉>檸檬酸。

關鍵詞：蘆筍；多酚氧化酶；酶活性；褐變

1 引言

1.1 蘆筍概述

1.1.1 蘆筍概況

蘆筍（asparagus officinalis.L）又稱石刁柏、龍須菜，屬百合科天門冬屬多年生宿根草本植物，雌雄異株。蘆筍的食用部分是嫩莖，根據采收時蘆筍的顏色，可分為白蘆筍和綠蘆筍兩種，蘆筍主要含維生素、蛋白質、礦物質等，并富含多種活性成分。蘆筍含有18種氨基酸和鋅、銅、錳、硒等微量元素。蘆筍的營養成分豐富，維生素含量為一般蔬菜的2～5倍，對膽結石、高血壓、心血管病、白血病等疾病均有療效，而且對尼古丁中毒、神經病、皮炎、結核病等也有食療作用。

1.1.2 蘆筍的褐變

蘆筍在加工過程中發生的酶促褐變，酶促褐變是在有氧條件下，由于多酚氧化酶（PPO）的作用，鄰位的酚氧化為醌，醌很快聚合成為褐色素而引起組織褐變。PPO是發生酶促褐變的主要酶，存在于大多數果蔬中。在大多數情況下，由于 PPO 的作用，不僅有損于果蔬感觀，影響產品運銷，還會導致風味和品質下降，特別是在熱帶鮮果中，酶促褐變導致的直接經濟損失達50%。

1.2 多酚氧化酶概述

多酚氧化酶（polypHenol oxidase，簡稱PPO）在植物界分布廣泛，是最早研究的幾類酶之一。多酚氧化酶大體上可分為兩類：漆酶和兒茶酚氧化酶，一般認為，PPO在植物抗病中起著重要作用，多酚氧化酶是植物體中不可或缺的一種酶，對于植物的正常生命活動有著極重要的作用。

本試驗通過紫外-可見分光光度計在412nm波長處探索蘆筍中PPO的最適pH、溫度，為工業生產提供滅活PPO工藝的理論基礎；通過研究底物濃度、熱穩定性對PPO活力的影響，為控制蘆筍貯藏加工中褐變的發生奠定理論基礎，為控制酶褐變提供經濟簡便的方法，提高其營養價值，外觀品質等均有重要的作用。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

蘆筍：泰安亞細亞食品有限公司生產基地。

2.2 主要試劑與器材

2.2.1 主要試劑：磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉聚乙烯吡咯烷酮k30鄰苯二酚；檸檬酸無水亞硫酸鈉抗壞血酸L-半胱氨酸

2.2.2 主要器材：電子天平數顯恒溫水浴鍋數顯恒溫水浴鍋紫外可見分光光度計微量進樣器（0～1000μl）燒杯、容量瓶、玻璃棒、稱量紙、移液管、比色皿等。

2.3 試驗方法

2.3.1 試劑的配制

pH為6.8的磷酸鹽緩沖溶液：用萬分之一天平準確稱取15.6050g磷酸二氫鈉溶解定容至500ml，準確稱取35.8140g磷酸氫二鈉溶解定容至500ml，二者溶液濃度均為0.2mol/L，由磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（0.2mol/L）配制表配制得pH為6.8的緩沖液。

廣范圍緩沖液所需檸檬酸溶液的配制：準確稱取2.1014g檸檬酸，用去離子水溶解后定容至100ml。

鄰苯二酚溶液的配制：準確稱取1.982g鄰苯二酚用去離子水溶解后定容至100ml，即可得濃度為0.18mol/L的鄰苯二酚溶液。

2.3.2 蘆筍多酚氧化酶的提取

準確稱取20g新鮮蘆筍樣品，置于研缽中，按照1：2（m/V）加入40ml pH 6.8的磷酸鹽緩沖液、按1%（w/v）加入0.2g PVPP，冰浴條件下迅速研磨成勻漿，4℃條件下浸提1h后過濾，所得澄清濾液即為所需粗酶液，4℃條件下保存，備用。取三分之一試管粗酶液于沸水浴中滅活15min，冰水冷卻、備用。

2.3.3 蘆筍多酚氧化酶活性測定

取pH6.8磷酸鹽緩沖液2.8ml，2ml 0.18mol/L鄰苯二酚溶液，多酚氧化酶粗酶液0.2ml，迅速搖勻計時。以加入pH6.8磷酸緩沖液2.8ml，2ml 0.18mol/L鄰苯二酚溶液，經沸水浴處理15min滅活的粗酶液0.2ml的體系為空白，于412nm條件下測定其吸光值變化，每隔30s計數一次，測定吸光度并計算酶活力。規定每毫升酶液在1min內吸光值增加0.01為1個酶活力單位。

2.3.4 底物濃度對PPO活性的影響

取pH為6.8的磷酸緩沖液2.8ml，分別加入2ml 0.1、0.15、0.18、0.2、0.3、0.4mol/L的鄰苯二酚溶液，置于30℃水浴鍋中預熱，然后加入0.2ml粗酶液，對照加入0.2ml的滅活酶液，保溫15min，于412nm條件下測定吸光度。由吸光值與底物濃度的線性關系，確定最佳底物濃度。

2.3.5 pH對PPO活性的影響

分別用pH3.0、4.0、5.0、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、8.0的緩沖溶液取代0.2mol/LpH6.8的磷酸鹽緩沖液，加入最適底物濃度的鄰苯二酚2ml置于30℃水浴鍋中預熱，然后加入0.2ml粗酶液，對照加入0.2ml的滅活酶液，保溫15min，于412nm條件下測定吸光度，得出吸光值與緩沖溶液pH的線性關系，確定多酚氧化酶最佳反應pH。

2.3.6 溫度對PPO活性的影響

將酶促反應混合液分別在20、30、40、50、60、70℃條件下水浴反應15min，參照2.3.5的方法測定吸光度得出吸光值與反應溫度的線性關系，確定最佳反應溫度。

2.3.7 多酚氧化酶的熱穩定性測定

將酶液分別在70℃、80℃、90℃水浴中加熱1、2、3、4、5min后冷卻備用，再參照2.3.5的方法測定412nm條件下的吸光度，得出吸光值與不同溫度下處理時間的關系，從而確定某一溫度下抑制多酚氧化酶活性的最短處理時間。

2.3.8 抑制劑對PPO活性的影響

本試驗中主要研究檸檬酸、抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉四種抑制劑對多酚氧化酶活性的抑制作用，通過加入不同濃度的抑制劑，找出能夠起到抑制作用的最低濃度。將緩沖液減少至2.0ml，并加入0.8ml抑制劑，再參照2.3.5的方法測定412nm條件下的吸光度，得出吸光值與抑制劑濃度關系，從而確定最佳抑制劑及其最佳抑制濃度。

3結束語

3.1 本試驗條件下蘆筍組織中多酚氧化酶的最適底物濃度為0.2mol/L，最適pH為6.6，最適作用溫度為40℃。耐熱性試驗表明：70℃處理4min， 80℃處理2min或90℃處理1min可使酶基本失活。

3.2 本試驗中各種抑制劑對蘆筍PPO都有不同的抑制作用，抑制效果由強到弱是：抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸鈉>檸檬酸。其中，抗壞血酸的最低抑制濃度為0.1%，L-半胱氨酸的最低抑制濃度為0.15%，亞硫酸鈉為0.2%，檸檬酸為0.25%。