抑制麻風樹潰瘍病病原菌的土壤細菌篩選

摘 要：通過稀釋涂布法分離得土壤細菌63株，采用對峙生長法篩選出營養競爭性抑制麻風樹潰瘍病病原菌的菌株4株，并進行了初步鑒定，抑制菌株均為革蘭氏陽性球菌，有英膜，厭氧或兼性厭氧，具有一定的耐鹽性。經初步測定，WT2-2-2-a菌株的抑菌率最高，達42.3%。

關鍵詞：麻風樹；潰瘍??；土壤細菌；抑制作用；營養競爭

中圖分類號 S718 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）14-27-02

Screening of Soil Bacteria Inhibiting Canker of Jatropha curcas

Guo Jianwei1 et al.

（1 College of Life Science and Technology，Key Laboratory of Higher Quality and Efficient Cultivation and Security Control of Crops for Yunnan Province，Honghe University，Mengzi 661100，China）

Abstract：63 strains rhizobacteria were isolated soil samples by streak platemethod ，subquencely 4 nutrient competent strains controlling Botrosphaeria fuliginosa （Moug. et Nestl.） Ell. et Ev. were screened by tablet coating method. 4 strains above were G+ coccus.

Key words：Jatropha curcas；Canker；Soil bacteria；Inhibit；Nutrient competent

麻風樹（Jatropha curcas L.）別名黑皂樹、膏桐、臭油桐、木花生、小桐子等，是大戟科（Euphorbiaceae）麻風樹屬落葉灌木或小喬木，具有速生、耐旱、耐貧瘠、含油率高的特點，野生條件下病蟲害少；其莖、葉、樹皮均有充沛的富含毒蛋白的白色乳汁，可提取生物醫藥和生物農藥；種殼、種子均含油，尤其是種子含油率達31.1%～47.2%，可加工生物柴油[1-3]。

據武建榕2008年首次報道，小桐子潰瘍病最初發生于嫁接的插穗上，病原菌為褐黑葡萄座腔菌[Botrosphaeria fuliginosa（Moug. et Nestl.）Ell.et Ev.]和Pseudoseptoria sp1。其癥狀表現為：初期插穗的地上部分枯死，后期干燥條件下出現許多半埋生于表皮層的黑褐色小點，最終生根的插條枯死[4]。據呂相賢、何家柏、郭建偉調查，云南省雙柏縣、建水縣、蒙自縣、元陽縣的小桐子種植林均發生了嚴重的莖潰瘍病，經病原菌分離、鑒定為褐黑葡萄座腔菌。目前，上述地區的小桐子屬于粗放式管理，每3a施藥施肥一次，農藥以多菌靈、代森錳鋅為主，防治效果不佳；此外，利用生物防治該病害的研究還鮮見報道。

植物土壤細菌是指存在于植物根際土壤中的一類與植物互利共生的細菌，對植物無可見危害。1978年Burr和Schroth首先報道馬鈴薯根際土壤細菌，隨后國內外研究已經證實多種根際土壤細菌的廣泛存在，目前報導最多的根際土壤細菌菌株有假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、農桿菌屬（Agrobacterium）、埃文氏菌屬（Eriwinia）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、巴斯德氏菌屬（Pasteuria）等[5]。王麗珍等從煙草根際土壤中分離出對煙草青枯病菌有拮抗活性的菌株348株，經復篩還發現：其中29株菌對赤星菌的抑菌帶寬達8.0～12.0mm，26株菌對黑脛菌的抑菌帶寬達9.0～14.0mm，31株菌對青枯菌的抑菌圈直徑達30.0～42.0mm[6]。因而，從小桐子能源林土壤分離潰瘍病拮抗性細菌，具有一定的可行性和潛在的應用價值。

1 材料與方法

1.1 土樣 小桐子根際土壤樣品由何家柏和呂相賢于2011年10月采集自蒙自市草壩鎮碧色寨麻瘋樹能源林；分別從溝底（土壤較濕潤、肥沃，腐殖質多）、坡上（土壤干燥、貧瘠，以砂石為主）的林中5點取樣，共10份土樣。

1.2 病原菌活化 將分離自上述地點的褐黑葡萄座腔菌轉接在新鮮PDA培養基上，活化、備用。

1.3 培養基 PDA培養基：葡萄糖20g、馬鈴薯200g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL，pH自然（對峙培養篩選拮抗性細菌時加20g蛋白胨）；NA培養基：牛肉膏3g、NaCl5g，蛋白胨10g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL，pH7.0～7.2 [7]。

以上相應的固體或液體培養基以加瓊脂與否為標準。

1.4 土壤細菌的分離、純化 常規平板稀釋培養法分離土壤細菌并經劃線法純化[7]。

1.5 拮抗細菌的篩選與相對抑制率測定 采用3點接種法將細菌與病原菌接種在加有蛋白胨的PDA培養基上，28℃恒溫培養5～14d，觀察是否抑制病原菌；如抑制，則計算相對抑菌率[8]。

相對抑菌率（%）=（病原菌菌落半徑-病原菌接種點到凹痕的距離）/菌落半徑×100。

1.6 抑制菌株的形態及部分生理生化測定 對抑制病原菌的細菌菌株進行革蘭氏染色、莢膜染色、運動性測試、接觸酶反應等基本的形態學與生理生化測定[7]。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌的分離 從10份土壤樣品中分離出具有不同菌落特征的細菌63株，說明麻風樹根際土壤具有較為豐富的細菌資源。

2.2 抑制病原菌的土壤細菌的篩選與相對抑菌率 采用對峙生長法篩選出4株覆蓋病原菌菌絲并阻止其進一步生長的細菌，其菌落特征及抑菌作用見表1和圖1。

表1 對小桐子潰瘍病病原菌具有抑制作用的4個菌株特征

[篩選菌株＼菌落色澤＼菌落特征＼相對抑菌率（%）＼WT4-1＼乳白色＼較濕潤、光滑、透明＼21.4＼WT2-1-2＼乳黃色＼干燥、邊沿整齊、不透明＼16.7＼WT2-2-2-a＼淡乳黃色＼濕潤、光滑、透明＼42.3＼WT2-2-2-b＼淡乳黃色＼濕潤、光滑、不透明＼38.6＼]

注：A.WT2-2-2-a菌株對潰瘍病病原菌抑制作用；B.WT2-1-2菌株對潰瘍病病原菌的抑制作用；C.病原菌

圖1 篩選菌株對潰瘍病病原菌的抑制作用

2.3 抑制病原菌的土壤細菌的初步鑒定 如表2所示，4株細菌均為革蘭氏陽性球菌，有莢膜，厭氧或兼性厭氧，都可以在含5%NaCl的培養基上生長，具有一定的耐鹽性。其中，WT4-1接觸酶反應陰性，在7%NaCl的培養基上不能生長，其余菌株接觸酶反應均為陽性，耐7%NaCl但不耐10%NaCl；WT2-1-2不具備運動性，其余菌株沿穿刺線云霧狀生長，均具有運動性。

表2 拮抗菌株生理生化鑒定

[菌株＼革蘭氏染色＼莢膜染色＼運動性＼厭氧性測定＼耐鹽性試驗＼接觸酶反應

（3% H2O2）＼2%NaCl＼5%NaCl＼7%NaCl＼10%NaCl＼WT4-1＼+，球菌＼+＼+＼厭氧＼+＼+＼-＼-＼-＼WT2-1-2＼+，球菌＼+＼-＼兼性厭氧＼+＼+＼+＼-＼+＼WT2-2-2-a＼+，球菌＼+＼+＼兼性厭氧＼+＼+＼+＼-＼+＼WT2-2-2-b＼+，球菌＼+＼+＼兼性厭氧＼+＼+＼+＼-＼+＼]

3 小結與討論

3.1 土壤細菌的分離、純化 本試驗采用稀釋涂布平板法從小桐子能源林土壤樣品中共分離到63株形態各異的土壤細菌，說明小桐子根部土壤細菌具有豐富的多樣性，與前人關于植物根際細菌普遍存在的觀點是相符的。

3.2 抑制病原菌細菌的篩選 據報道，根際土壤微生物可通過侵染位點的隔離與重寄生、營養競爭、拮抗作用等抑制植物病原菌[5，6，8-10]。本試驗通過對峙生長法發現：4株細菌雖然不產生抑菌圈但會覆蓋褐黑葡萄座腔菌菌絲并抑制其生長，4菌株可能通過營養競爭作用抑制病原菌。

前人對土壤細菌的研究多數是對有關草本作物而非喬本植物，雖然不能簡單類比，但顯然本研究分離到的抑制病原菌菌株的概率偏低。褐黑葡萄座腔菌在麻風樹莖干上導致潰瘍病，尚無土傳的研究報道，本研究以其為靶標從土壤篩選抑制性菌株，但土壤中抑制該菌的細菌與其他微生物相比缺乏生存優勢而難以篩選出來，可能是本研究分離抑制性菌株偏小的原因。

致謝：特別感謝紅河學院2008級呂相賢提供病害調查數據，感謝李河、全舒舟老師在試劑采購中給予幫助。

參考文獻

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（上接28頁）[7]周德慶.微生物實驗手冊[M ].上海：上?？萍汲霭嫔?，1986：97-115.

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