水蘇糖合成酶基因重組載體的構建及轉化農桿菌

摘 要：以黃瓜葉片中提取的總RNA為模板，經PCR擴增得到長度為1 275bp的基因片斷，經過酶切測序之后，將目的基因連接到表達載體，構建成重組質粒。再利用液氮凍融法將表達載體轉化農桿菌感受態。

關鍵詞：水蘇糖合成酶基因；載體構建；轉化農桿菌

中圖分類號 Q789 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）14-20-03

Construction of Stachyose Synthase Gene Vector and Transformation to Agrobacterium

Jiang Dan et al.

（Heilongjiang Bayi Agriculture University，Collge of Life，Daqing 163319，China）

Abstract：STS gene of 1 275bp length from Cucumis sativus were cloned by RT-PCR，and were connected with cloned-vector. After sequencing and comparing with the gene showed on Genbank，absolutely accurate gene sequence which was amplied with two peculiar primier and primestar enzyme were inserted into expression vector。 STS recombined plasmid were successfully constructed，then were transformed to Agrobacterium.

Key words：STS gene；Expression vector construction；Transformation to Agrobacterium

黃瓜（Cucumis sativus L.）以水蘇糖作為光合產物的主要運輸形式。水蘇糖合成酶（Stachyose synthase）是水蘇糖生物合成的關鍵酶，研究水蘇糖合成酶基因則是研究黃瓜糖代謝機理的第一步。因此，筆者以黃瓜為試驗材料，分離了STS基因，將其連接到植物表達載體并轉化農桿菌，為基因的功能鑒定及轉基因研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 黃瓜品種為“中農8號”，表達載體，農桿菌菌株EHA105。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物RNA的提取 黃瓜葉片中RNA的提取使用天根公司的TRIZOLA+試劑盒。

1.2.2 RNA反轉錄 反轉錄試驗使用Promega公司的試劑盒進行，在0.2mL PCR管中依次加入以下組分：

（1）葉片總 RNA 3μg；OligodT（18） 2μL； 70℃保持 5min，立即放回冰上。（2）5×RT MLV Buffer 5μL；10mmol/L dNTP Mix 1.25μL；Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.6μL；M-MLV Reverse Transcriptase 1μL；RNase-free water 補足至 25μL。42℃反應1h。

1.2.3 STS基因的克隆 按照Genbank上提供的序列設計引物，5′端引入SalⅠ酶切位點，3′端引入SpeⅠ酶切位點：

上游引物 5′—CGC GTCGAC ATGGACGTAGACTGAAGTCGA—3′

下游引物：5′—CGC ACTAGTRRACGTAAATCGATCGGCTGA—3′

PCR體系：菌液0.5μL；2x PCR master mix 10μL；上下游引物1.6μL； DNA聚合酶 0.3μL；ddH2O 7.6μL。PCR程序設置：94℃預變性5min，94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1.25min，72℃延伸10min，30循環。

運用中原生物公司的膠回收試劑盒對目的片段進行切膠回收，然后將目的片段連接克隆載體。之后將連接產物轉化大腸桿菌感受態。

1.2.4 菌斑鑒定 挑單菌落直接接種到含有Amp的LB液體培養基中，37℃、180rpm培養過夜。以菌液作為模板，用目的基因的上下游引物進行PCR反應，反應體系及條件同上。……