水蘇糖合成酶基因重組載體的構建及轉化農桿菌

摘 要：以黃瓜葉片中提取的總RNA為模板，經PCR擴增得到長度為1 275bp的基因片斷，經過酶切測序之后，將目的基因連接到表達載體，構建成重組質粒。再利用液氮凍融法將表達載體轉化農桿菌感受態。

關鍵詞：水蘇糖合成酶基因；載體構建；轉化農桿菌

中圖分類號 Q789 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）14-20-03

Construction of Stachyose Synthase Gene Vector and Transformation to Agrobacterium

Jiang Dan et al.

（Heilongjiang Bayi Agriculture University，Collge of Life，Daqing 163319，China）

Abstract：STS gene of 1 275bp length from Cucumis sativus were cloned by RT-PCR，and were connected with cloned-vector. After sequencing and comparing with the gene showed on Genbank，absolutely accurate gene sequence which was amplied with two peculiar primier and primestar enzyme were inserted into expression vector。 STS recombined plasmid were successfully constructed，then were transformed to Agrobacterium.

Key words：STS gene；Expression vector construction；Transformation to Agrobacterium

黃瓜（Cucumis sativus L.）以水蘇糖作為光合產物的主要運輸形式。水蘇糖合成酶（Stachyose synthase）是水蘇糖生物合成的關鍵酶，研究水蘇糖合成酶基因則是研究黃瓜糖代謝機理的第一步。因此，筆者以黃瓜為試驗材料，分離了STS基因，將其連接到植物表達載體并轉化農桿菌，為基因的功能鑒定及轉基因研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 黃瓜品種為“中農8號”，表達載體，農桿菌菌株EHA105。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物RNA的提取 黃瓜葉片中RNA的提取使用天根公司的TRIZOLA+試劑盒。

1.2.2 RNA反轉錄 反轉錄試驗使用Promega公司的試劑盒進行，在0.2mL PCR管中依次加入以下組分：

（1）葉片總 RNA 3μg；OligodT（18） 2μL； 70℃保持 5min，立即放回冰上。（2）5×RT MLV Buffer 5μL；10mmol/L dNTP Mix 1.25μL；Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.6μL；M-MLV Reverse Transcriptase 1μL；RNase-free water 補足至 25μL。42℃反應1h。

1.2.3 STS基因的克隆 按照Genbank上提供的序列設計引物，5′端引入SalⅠ酶切位點，3′端引入SpeⅠ酶切位點：

上游引物 5′—CGC GTCGAC ATGGACGTAGACTGAAGTCGA—3′

下游引物：5′—CGC ACTAGTRRACGTAAATCGATCGGCTGA—3′

PCR體系：菌液0.5μL；2x PCR master mix 10μL；上下游引物1.6μL； DNA聚合酶 0.3μL；ddH2O 7.6μL。PCR程序設置：94℃預變性5min，94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1.25min，72℃延伸10min，30循環。

運用中原生物公司的膠回收試劑盒對目的片段進行切膠回收，然后將目的片段連接克隆載體。之后將連接產物轉化大腸桿菌感受態。

1.2.4 菌斑鑒定 挑單菌落直接接種到含有Amp的LB液體培養基中，37℃、180rpm培養過夜。以菌液作為模板，用目的基因的上下游引物進行PCR反應，反應體系及條件同上。

1.2.5 質粒DNA提取 按照分子克隆（第三版）堿裂解法小提質粒。

1.2.6 STS基因質粒的酶切 （1）雙酶切反應體系：10×buffer 2μL；Sal I：1μL；Spe I：1μL；質粒：2μL；ddH2O 14μL；合計20μL。（2）37℃，靜置3h。（3）加入2μL 10×loading buffer，電泳檢測，切膠回收。

1.2.7 重組質粒的連接及鑒定 （1）連接體系：目的基因膠回收產物8μL；表達載體0.5μL；10×buffer 1μL；T4DNA ligase 0.5μL；4℃過夜。（2） 將連接產物轉入大腸桿菌，涂在含抗生素的LB固體培養基上，37℃倒置培養14h。（3）挑單菌落：用含抗生素LB 液體培養基搖菌12～13h。（4）菌斑鑒定：用菌液作為模板，以目的片段的上下游引物進行PCR，挑出連接正確的菌落。從PCR正確的菌液中小提質粒，作雙酶切鑒定，找出連接正確的克隆。

1.2.8 凍溶熱擊法轉化農桿菌感受態 （1）取200μL農桿菌感受態細胞，加入1μg構建好的質粒DNA，混勻，冰浴30min。（2）液氮中速凍1min，37℃水浴5min。（3）加入lmL YEB培養基，28℃慢速振蕩培養4h。（4）10 000rpm離心30s，棄上清。（5）加入0.1mL YEB重新懸浮細胞，涂布于含有抗生素的YEB培養基上，28℃培養。（6）轉化后鑒定：挑取單菌落，接種于含有抗生素的YEB液體培養基中28℃振蕩培養過夜，以農桿菌菌液為模板，進行菌液PCR，鑒定陽性克隆。

2 結果與分析

2.1 STS基因的克隆、酶切及其測序 結果如圖1所示，自黃瓜葉片中的cDNA擴增出大小約為1 300bp的片段，與預期片段相符，將其連接到克隆載體，對陽性質粒進行酶切和測序，結果如圖2所示。

Lane1：STS 基因；Lane2：DL2000 Marker

圖1 STS基因擴增片段電泳檢測

Lane1、2：STS基因酶切產物；Lane3：DL 2000 Marker

圖2 STS基因酶切產物電泳驗證

2.2 STS重組質粒的鑒定 STS基因酶切產物經電泳后獲得目的片段，膠回收酶切產物，用T4 DNA ligase 將回收產物連接到表達載體，連接產物轉化大腸桿菌，提取質粒酶切鑒定找出連接正確的克隆。對重組質粒用限制性內切酶SalⅠ和SpeⅠ進行雙酶切，結果如圖3所示，重組質粒切出1 275bp的片斷，說明重組質粒構建成功。

2.3 重組質粒轉化農桿菌 將重組質粒經液氮凍融法轉化EHA105感受態，轉化菌液鋪于含有抗生素的YEB平板，28℃倒置培養2～3d后，隨機挑取2個單菌落進行PCR擴增，結果顯示出現大約1 300bp的PCR產物（圖4）；和STS基因的片段相同，說明植物重組質粒插入農桿菌EHA105。

Lane1：DL 2000 Marker；Lane2、3∶STS基因的酶切產物；Lane4：DL 15000 Marker

圖3 STS-Super1300+質粒雙酶切電泳檢測

Lane1：DL 2000 Marker；lane2：陰性對照；lane3：陽性轉化子

圖4 STS農桿菌轉化子的PCR鑒定

3 討論

STS基因編碼450個左右的氨基酸，具有轉錄因子的特性，現有研究已經在STS同源基因編碼區結構與功能方面取得進展。研究使用Super 1300+植物表達載體，前端有超強啟動子，高效誘導外源插入基因的表達，STS基因沒有Sal I和Spe I酶切位點，且雙酶的酶切反應溫度和緩沖液均相同，故選用2種酶的酶切識別位點置于目的基因的引物之前，用連接酶將目的基因連接到表達載體中構建目的基因重組質粒，并轉化農桿菌中，為進一步鑒定STS基因的功能和研究黃瓜代謝機理奠定了基礎。

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