一氧化氮對(duì)靈芝木質(zhì)素與多糖含量的影響研究

摘 要：采用硝普鈉（Sodium nitroprusride，SNP）作為外源一氧化氮（nitric oxide，NO）供體，研究一氧化氮對(duì)靈芝產(chǎn)量、木質(zhì)素和靈芝多糖含量的影響。結(jié)果表明，5mmol/L SNP處理促進(jìn)靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)，并顯著提高靈芝多糖含量，降低木質(zhì)素含量；當(dāng)SNP處理濃度達(dá)到20mmol/L時(shí)，將抑制靈芝多糖的積累。

關(guān)鍵詞：靈芝；一氧化氮；木質(zhì)素；靈芝多糖

中圖分類號(hào) S646 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）14-19-02

靈芝是一種藥食兼用真菌，在我國(guó)有著悠久的應(yīng)用歷史。靈芝子實(shí)體具有抑制腫瘤、抗血栓形成、防止動(dòng)脈硬化、提高人體免疫力、鎮(zhèn)痛及延遲細(xì)胞衰老等功效[1-3]，其主要含有多糖和靈芝酸等其他有效化學(xué)成分[4]。與猴頭菇、灰樹(shù)花、姬松茸等肉質(zhì)化的食藥用真菌子實(shí)體相比，靈芝子實(shí)體含有高達(dá)70%以上的纖維素和木質(zhì)素，使得其不能直接食用，只能通過(guò)適當(dāng)?shù)奶崛」に囂崛《嗵呛挽`芝酸等有效藥用成分。然而，提取過(guò)程復(fù)雜，且有效成分有損失、提取不完全，從而大大限制了子實(shí)體的藥用價(jià)值和靈芝產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，如何降低靈芝木質(zhì)素含量一直是靈芝產(chǎn)業(yè)所關(guān)注的重要課題。本文采用生物信號(hào)分子一氧化氮（NO）供體硝普鈉作為靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)過(guò)程中次生代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)劑，研究一氧化氮對(duì)靈芝木質(zhì)素和多糖含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 靈芝菌種（Ganoderma lucidum）由上海農(nóng)科院食用所提供。蔗糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、乙醇、蛋白胨、葡萄糖、硝普鈉（Sodium nitroprusride，SNP，購(gòu)自Sigma公司）、氫氧化鈉、3，5-二硝基水楊酸、濃硫酸、瓊脂、苯酚、酒石酸鉀鈉、無(wú)水硫酸鈉。

1.2 儀器與設(shè)備 JA2003N型電子分析天平、756-MC型可見(jiàn)分光光度計(jì)、YXQ-LS50S11立式壓力蒸汽滅菌器、HZ-300L恒溫?fù)u床、HH·B11·420-S電熱恒溫培養(yǎng)箱、TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)、HH-6恒溫水浴鍋，SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)、XHF-D高速分散器、北京博醫(yī)訊冷凍干燥機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 靈芝栽培與處理 采用棉籽殼44%，雜木屑44%，麩皮5%，玉米粉5%，蔗糖1%，石膏粉1%配方配制培養(yǎng)基。選用500mL罐頭瓶栽培，每瓶裝干料150g，常規(guī)滅菌接種后，于25℃左右條件下培養(yǎng)，經(jīng)20d發(fā)菌培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長(zhǎng)至1/2瓶時(shí)，可以除去封口紙，搬至子實(shí)體發(fā)生室。此時(shí)控溫25～28℃，相對(duì)濕度增至90%～95%，保持空氣清新，增強(qiáng)漫射光。待長(zhǎng)出菇蕾時(shí)每隔4d用0、0.5、1、5、10、20mmol/L濃度的硝普鈉（NO供體）進(jìn)行表面噴施，每組重復(fù)10瓶，共處理10次。在彈孢期后采收子實(shí)體，并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 木質(zhì)素含量測(cè)定 子實(shí)體于60℃烘箱烘干后粉碎，過(guò)40目篩后，用于測(cè)定靈芝木質(zhì)素含量。木質(zhì)素含量的測(cè)定參照鞠志國(guó)等的方法[5]。按1∶10（W/V）加入沸水，冷卻后加入86%硫酸25mL，室溫下充分?jǐn)嚢?h，加入250mL dH2O煮沸1h，冷卻后用烘干至恒重的砂芯濾斗抽濾，用60℃熱dH2O洗滌至洗液與10%BaCl2反應(yīng)時(shí)不出現(xiàn)沉淀為止，砂芯濾斗烘干后稱重。按以下式計(jì)算木質(zhì)素含量：

木質(zhì)素（%）=[（抽濾后漏斗重-抽濾前漏斗重）/樣品重]×100

1.3.3 靈芝多糖提取與含量測(cè)定 （1）靈芝多糖提取。采集子實(shí)體，60℃烘箱烘干后粉碎，過(guò)40目篩后，用于測(cè)定靈芝多糖含量。稱取0.100g，加入5mL1mol/L NaOH，60℃水浴1h，然后6 000rpm離心10min，取上清液，得多糖樣品粗提液。再用Sevag法除去蛋白，在4℃用去離子水透析24h、60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮、-45℃真空冷凍干燥36h。（2）靈芝多糖含量的測(cè)定。稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖10mg，用蒸餾水定容至250mL制成40μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。取試管分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，用ddH2O補(bǔ)齊至2.0mL；加入6.0%苯酚、1mL ddH2O、98%濃硫酸5.0mL。混勻后于485nm測(cè)定光密度值。以葡萄糖含量（μg）為橫坐標(biāo)（x），光密度值為縱坐標(biāo)（y），作出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.009 1x-0.006 7，R2=0.993 6。取0.1mL多糖提取液，加入1.9mL ddH2O、6.0%苯酚、1mL ddH2O、98%濃硫酸5.0mL，混勻后于485nm測(cè)定光密度值。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.3.4 靈芝產(chǎn)量測(cè)定 在彈孢期后采收，用電子天平稱取子實(shí)體質(zhì)量。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)各處理重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，各樣品組間差異顯著性采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行分析處理，兩均數(shù)間差異顯著性采用雙尾t檢驗(yàn)。所用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS10。（下轉(zhuǎn)22頁(yè)）（上兿19頁(yè)）2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度SNP對(duì)靈芝產(chǎn)量的影響 0～20mmol/L SNP處理對(duì)靈芝子實(shí)體產(chǎn)量變化情況如圖1所示。0.5、10和20mmol/L SNP處理組子實(shí)體干物質(zhì)積累與對(duì)照無(wú)顯著差異（P>0.05）。當(dāng)SNP濃度達(dá)到1和5mmol/L時(shí)則顯著促進(jìn)靈芝菌絲生長(zhǎng)（P<0.05），5mmol/L時(shí)子實(shí)體干重達(dá)到峰值，為對(duì)照組的1.11倍，生物學(xué)效率為112%。

圖1 不同濃度SNP對(duì)靈芝子實(shí)體產(chǎn)量的影響

2.2 不同濃度SNP對(duì)靈芝木質(zhì)素含量的影響 0.5、1、10和20mmol/L SNP處理組子實(shí)體木質(zhì)素含量與對(duì)照無(wú)顯著差異（P>0.05）。當(dāng)SNP濃度達(dá)到5mmol/L時(shí)子實(shí)體木質(zhì)素含量最低，為靈芝子實(shí)體干重的10.6%，顯著低于對(duì)照組的113.6%（P<0.05）。

圖2 不同濃度SNP對(duì)靈芝子實(shí)體木質(zhì)素含量的影響

圖3 不同濃度SNP對(duì)靈芝子實(shí)體多糖含量的影響

2.3 不同濃度SNP對(duì)靈芝多糖含量的影響 0.5和10mmol/L SNP處理組子實(shí)體靈芝多糖含量與對(duì)照無(wú)顯著差異（P>0.05）。當(dāng)SNP濃度達(dá)到1和5mmol/L時(shí)多糖含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），分別比對(duì)照組高23.3%和34.5%。當(dāng)SNP處理濃度為10mmol/L，子實(shí)體靈芝多糖含量則顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

3 討論

一氧化氮（NO）是一種氣體生物信號(hào)分子，廣泛參與真菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和環(huán)境因子脅迫條件下次生代謝產(chǎn)物的積累[6-8]。Zheng等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的NO能夠誘導(dǎo)樺褐孔菌酚類化合物的積累。Kong等[10]報(bào)道，37℃熱脅迫刺激深層發(fā)酵白靈菇菌絲體NO的產(chǎn)生，外源NO供體硝普鈉能誘導(dǎo)白靈菇菌絲細(xì)胞內(nèi)海藻糖生物合成相關(guān)酶基因的表達(dá)而降低細(xì)胞內(nèi)膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛含量，從而增強(qiáng)耐熱性。本研究發(fā)現(xiàn)，5mmol/L SNP能顯著提靈芝子實(shí)體產(chǎn)量、提高靈芝多糖含量，降低木質(zhì)素含量；當(dāng)SNP處理濃度達(dá)到20mmol/L時(shí)，將抑制靈芝多糖的積累。有關(guān)NO降低靈芝木質(zhì)素含量而誘導(dǎo)靈芝多糖合成的生物化學(xué)機(jī)理正在進(jìn)一步研究之中。

參考文獻(xiàn)

[1]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].3版.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007，1-359.

[2]Tang YJ ，Zhong JJ.Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid[J].Enzyme and Microbial Technology，2002，31（1）： 20-28.

[3]李明春，雷林生，王慶彪.靈芝多糖對(duì)小鼠T細(xì)胞胞漿游離Ca2+濃度和胞內(nèi)pH的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，17（2）：167-170.

[4]藺麗，方能虎，吳旦.靈芝的主要生物活性研究概況[J].中國(guó)食用菌，2002，21（3）：38-40.

[5]鞠志國(guó)，劉成兵，原永兵.萊陽(yáng)仕梨酚類物質(zhì)合成的調(diào)節(jié)及其對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1993，26（4）：44-48.

[6]You BJ，Chang W，Chung KR.Effect of solid-medium coupled with reactive oxygen species on ganoderic acid biosynthesis and MAP kinase phosphorylation in Ganoderma lucidum[J].Food research int，2012，49： 634-640.

[7]Jayashree T，Subramanyam C.Oxidative stress as a prerequisite for aflatoxin production by Aspergillus parasiticus[J].Free radical biology medicine，2000，29（10）： 981-985.

[8]Aguirre J，Hansberg W，Navarro R.Fungal responses to reactive oxygen species [J].Medical Mycology，2006，44： 101-107.

[9]Zheng WF，Liu YB，Pan SY，Yuan WH.Involvements of S-nitrosylation and denitrosylation in the production of polyphenols by Inonotus obliquus[J].Appl Microbiol Biotechnol，2011，90： 1 763-1 772.

[10]Kong WW，Huang CY，Chen Q，Zou YJ，Zhang JX.Nitric oxide alleviates heat stress-induced oxidative damage in Pleurotus eryngii var tuoliensis[J].Fungal Genet Biol，2012，49： 15-20.