凡納對蝦crustin 2基因的序列及結構分析

摘要：以凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）crustin 2基因為研究對象，通過基因克隆、氨基酸序列比對、系統進化樹分析以及分子結構的初步預測。結果表明，crustin 2基因可能在凡納對蝦的先天免疫系統中發揮著重要的抗菌功能，是一個重要的免疫效應基因。

關鍵詞：凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）；crustin 2基因；克隆；分析

中圖分類號：S917.4；Q781 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4526-03

凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）具有良好的抗菌、抗病毒等遺傳特性。其先天免疫系統一直是研究熱點，科研工作者試圖通過研究抗菌、抗病毒相關的基因來發現凡納對蝦優良性狀的分子生物學基礎[1]。本研究以凡納對蝦crustin 2基因為研究對象，克隆了該基因的cDNA序列，并對基因序列的同源性、分子進化上的親緣關系、初級結構等進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納對蝦購自于包頭市友誼水產市場，并于超凈工作臺中剖取凡納對蝦肝胰腺、鰓等組織，用于提取總RNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 參照說明書，利用TRizol總RNA提取試劑盒提取凡納對蝦的肝胰腺和鰓等組織的總RNA[2]，于-80 ℃冰箱中保存備用。按照cDNA第一鏈合成試劑盒的操作說明書，將總RNA逆轉錄為cDNA。

1.2.2 目的片段的PCR擴增 以提取的凡納對蝦的總RNA反轉錄成的cDNA為模板進行PCR擴增[3]。利用前引物F和反轉錄使用的后引物3′ anchor R引物配對，來擴增目的基因的ORF的3′端序列；同時利用后引物R和反轉錄使用的前引物5′ PCR primer引物來擴增目的基因ORF的5′端序列，通過已有的中心片段以及兩端片段拼接來獲得基因的完整cDNA序列。

1.2.3 重組載體的構建與序列測定 使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因PCR擴增產物，將目的基因回收、純化之后，參照T載體PCR產物克隆試劑盒使用說明書，將目的基因片段克隆到T載體中，經過藍白斑篩選后，進行序列測定[4]。……