凡納對蝦crustin 2基因的序列及結構分析

摘要：以凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）crustin 2基因為研究對象，通過基因克隆、氨基酸序列比對、系統進化樹分析以及分子結構的初步預測。結果表明，crustin 2基因可能在凡納對蝦的先天免疫系統中發揮著重要的抗菌功能，是一個重要的免疫效應基因。

關鍵詞：凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）；crustin 2基因；克隆；分析

中圖分類號：S917.4；Q781 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4526-03

凡納對蝦（Litopenaeus vannamei）具有良好的抗菌、抗病毒等遺傳特性。其先天免疫系統一直是研究熱點，科研工作者試圖通過研究抗菌、抗病毒相關的基因來發現凡納對蝦優良性狀的分子生物學基礎[1]。本研究以凡納對蝦crustin 2基因為研究對象，克隆了該基因的cDNA序列，并對基因序列的同源性、分子進化上的親緣關系、初級結構等進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納對蝦購自于包頭市友誼水產市場，并于超凈工作臺中剖取凡納對蝦肝胰腺、鰓等組織，用于提取總RNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 參照說明書，利用TRizol總RNA提取試劑盒提取凡納對蝦的肝胰腺和鰓等組織的總RNA[2]，于-80 ℃冰箱中保存備用。按照cDNA第一鏈合成試劑盒的操作說明書，將總RNA逆轉錄為cDNA。

1.2.2 目的片段的PCR擴增 以提取的凡納對蝦的總RNA反轉錄成的cDNA為模板進行PCR擴增[3]。利用前引物F和反轉錄使用的后引物3′ anchor R引物配對，來擴增目的基因的ORF的3′端序列；同時利用后引物R和反轉錄使用的前引物5′ PCR primer引物來擴增目的基因ORF的5′端序列，通過已有的中心片段以及兩端片段拼接來獲得基因的完整cDNA序列。

1.2.3 重組載體的構建與序列測定 使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因PCR擴增產物，將目的基因回收、純化之后，參照T載體PCR產物克隆試劑盒使用說明書，將目的基因片段克隆到T載體中，經過藍白斑篩選后，進行序列測定[4]。

1.3 生物信息學分析

1.3.1 氨基酸序列比對 將凡納對蝦crustin 2基因的cDNA序列進行比對。用Expasy在線軟件對crustin 2基因進行翻譯，預測蛋白質序列信號肽和結構域；氨基酸序列比對利用分子生物學軟件DNAMAN完成[5]。

1.3.2 系統進化樹的繪制 根據凡納對蝦crustin 2基因序列比對的結果，選擇物種相近的生物的crustin 2基因，利用分子生物學軟件MEGA 4.0進行系統進化樹的繪制[6]。

1.3.3 分子結構的預測 根據Expasy在線軟件對凡納對蝦crustin 2基因序列進行翻譯的結果，利用SMART網站中蛋白質分子初級結構域預測工具進行分子結構的初步預測。

2 結果與分析

2.1 基因克隆和序列分析

以凡納對蝦各組織的總RNA反轉錄的cDNA作為模板，利用特異性引物F和R以及反轉錄過程中使用的引物5′ PCR primer和3′ anchor R擴增凡納對蝦crustin 2基因cDNA序列。結果（圖1）表明，凡納對蝦crustin 2基因cDNA序列的ORF長度為456 bp，編碼151個氨基酸；并且在ORF的下游2 bp處存在一個加尾信號AATAA序列。在氨基酸序列中，N端的18個氨基酸組成了信號肽序列，靠近C端的49個氨基酸形成了一個經典的WAP結構域，其中包括了8個保守存在的半胱氨酸。在信號肽序列與WAP結構域序列之間，存在著富含甘氨酸的基序以及保守存在的另外4個半胱氨酸。

2.2 氨基酸序列的同源性分析

將克隆得到的凡納對蝦crustin 2基因（Lva-crustin 2）cDNA序列，進行基因序列BLAST比對，選擇了cDNA序列同源性較高的5種相近物種的crustin基因，進行氨基酸序列的同源性比對分析。結果表明，巴西美對蝦（Farfantepenaeus brasiliensis）crustin基因（Fbr-crustin）、小褐美對蝦（Farfantepenaeus subtilis）crustin基因（Fsu-crustin）、南美藍對蝦（Penaeus stylirostris）crustin基因（Pst-crustin）、大西洋白對蝦（Litopenaeus setiferus）crustin基因（Lse-crustin）、斑節對蝦（Penaeus monodon）crustin基因（Pmo-crustin）均與凡納對蝦crustin 2基因（Lva-crustin 2）氨基酸序列上具有較高的同源性。氨基酸N端的信號肽序列的相似性較高，C端都存在著一個WAP結構域。信號肽序列與WAP結構域之間的富含甘氨酸的基序（Gly-rich motif）以及保守存在的另外4個半胱氨酸相似程度特別高。

2.3 凡納對蝦crustin 2與其他對蝦crustin的親緣關系分析

對凡納對蝦crustin 2基因（Lva-crustin 2）序列進行BLAST比對之后，利用分子生物學軟件MEGA 4.0進行相近物種的crustin系統進化樹的分析與繪制。結果（圖2）表明，凡納對蝦crustin 2與南美藍對蝦crustin（Pst-crustin）、大西洋白對蝦crustin（Lse-crustin）分布在進化樹的同一支上，說明親緣關系較近，也表現出了較高的氨基酸序列相似性。

2.4 凡納對蝦crustin 2的結構預測

利用蛋白質結構域預測工具SMART網站，對凡納對蝦crustin 2的結構進行初步預測。凡納對蝦crustin 2屬于典型的crustin類抗菌肽，存在經典的WAP結構域和信號肽序列，WAP結構域和信號肽序列之間存在另外4個保守的半胱氨酸以及一段富含甘氨酸殘基的結構基序。推測凡納對蝦crustin 2應該具有抗菌活性。

3 小結與討論

以凡納對蝦crustin 2基因（Lva-crustin 2）為研究對象，克隆了凡納對蝦crustin 2基因的cDNA序列，進行了氨基酸序列的比對分析以及通過繪制系統進化樹來分析各個對蝦crustin與凡納對蝦crustin-2之間的親緣關系情況，初步預測了分子結構。結果表明，凡納對蝦crustin 2屬于典型的甲殼肽抗菌肽，其氨基酸序列結構符合甲殼肽的結構特征，存在WAP結構域和富含甘氨酸的結構基序，推測凡納對蝦crustin 2應該具有抗菌活性，在凡納對蝦的先天免疫系統中可能發揮著重要的抗菌功能，為下一步基因功能的研究提供了重要的理論基礎。

參考文獻：

[1] DU Z Q， REN Q， ZHAO X F， et al. A double WAP domain （DWD）-containing protein with proteinase inhibitory activity in Chinese white shrimp， Fenneropenaeus chinensis[J]. Comp Biochem Physiol Part B： Biochem Mol Biol，2009，154（2）：203-210.

[2] DU Z Q， LI X C， WANG Z H， et al. A single WAP domain （SWD）-containing protein with antipathogenic relevance in red swamp crayfish， Procambarus clarkia[J]. Fish Shellfish Immunol，2010，28（1）：134-142.

[3] SUN C， DU X J， XU W T， et al. Molecular cloning and characterization of three crustins from the Chinese white shrimp，Fenneropenaeus chinensis[J]. Fish Shellfish Immunol，2010，28（4）：517-524.

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