姜的脫毒方法比較與繁殖生根同步化培養技術研究

摘要：考察了莖尖大小、熱處理催芽結合莖尖培養以及催芽后高溫熱處理結合莖尖培養等對姜（Zingiber officinale Rosc.）莖尖培養脫毒效果影響，并進行了脫毒姜試管苗的繁殖生根同步化培養基篩選。結果表明，0.3 mm的莖尖能夠獲得較為理想的成活率、成苗率，并且具有較好的脫毒效果；熱處理結合莖尖培養能夠提高脫毒效果，且催芽后高溫短時間熱處理的脫毒效果優于熱處理直接催芽；確定脫毒姜繁殖生根同步化培養的最佳培養基為MS+2.50 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.2～0.3 mg/L ABT，在此培養基上生長的試管苗長勢旺盛，根系發達，移栽成活率高。

關鍵詞：姜（Zingiber officinale Rosc.）；脫毒方法；分生組織培養；同步化培養

中圖分類號：S632.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4522-04

姜（Zingiber officinale Rosc.）屬姜科姜屬（Zingiber）為多年生宿根草本植物，其新鮮根莖既是日常餐桌上重要的調味品、保健品，也是常用的中藥材，為典型的藥食兩用經濟作物。生姜味辛、性微溫，歸肺、脾、胃經，具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳的功效，常用于治療感冒風寒、嘔吐、痰飲、喘咳、脹滿、泄瀉等，解半夏、天南星、魚蟹及鳥獸肉之毒[1]。

姜為無性繁殖作物，在長期的栽培過程中會受到多種病毒的侵染，并且不斷地在體內積累。研究表明侵染姜的病毒主要為黃瓜花葉病毒（CMV）和煙草花葉病毒（TMV）[2，3]。病毒與姜競爭生長必需的營養成分，使姜出現局部或系統花葉褪綠、植株矮化或葉畸形等癥狀，從而導致姜產量降低30%，嚴重者可減產45%以上，且品質和抗性也會受到不同程度的影響[4]。

目前，姜的無毒苗獲得方法主要有熱處理法和莖尖培養法。熱處理法需要在高溫、高濕環境中保存較長時間，且處理后的無毒苗較為疲軟，在組培接種時表面消毒不易徹底，目前基本上不單獨使用。近年來，使用莖尖培養對姜脫病毒的研究報道較多，但使用熱處理結合莖尖培養法進行姜脫病毒的系統性研究報道較少。本研究對姜進行改良熱處理結合莖尖培養，考察了莖尖大小、熱處理催芽后結合莖尖培養及催芽后熱處理結合莖尖培養的脫毒效果，并建立了脫毒姜試管苗的繁殖生根同步化組織培養體系，為脫毒姜苗的工廠化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

姜為采自山東省萊蕪市生姜產區的萊蕪大姜，植株的健康根莖儲藏至中國藥科大學遺傳育種教研室，經中國藥科大學遺傳育種教研室高山林教授復核為姜。

1.2 試驗方法

1.2.1 莖尖大小對脫毒效果影響的考察 將萊蕪大姜的姜塊用經50%多菌靈800倍液浸泡處理的細沙鋪底和覆蓋，在室溫（25 ℃）下催芽，待芽長至0.5～1.0 cm時，洗潔精清洗5 min，剝去外層葉子在自來水下沖洗30 min。在超凈工作臺上，用0.1%升汞溶液（加2～3滴吐溫-20）消毒8～10 min，無菌水沖洗3～5次。解剖鏡下剝取帶有3個約0.4～0.5 mm葉原基、約2個0.3 mm 葉原基、約1個0.2 mm 葉原基和不帶葉原基的莖尖分生組織接種到MS+2.00 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IAA培養基上培養60 d。每瓶接種3個莖尖，每個處理接種10瓶。培養溫度（25±2）℃，光照度1 500 lx，光照時間14～16 h/d。計算成活率、成苗率，并在電鏡下觀察脫毒效果。

1.2.2 熱處理催芽結合莖尖培養對脫毒效果影響的考察 根據莖尖培養的結果，取萊蕪大姜的姜塊，用經50%多菌靈800倍液浸泡處理的細沙鋪底和覆蓋，于36、40、44 ℃下催芽[5，6]，待芽長至2～3 cm時，切下1～2 cm的莖尖，按照莖尖剝取方法剝下約0.3 mm的莖尖分生點接種在MS+2.00 mg/L 6-BA +0.2 mg/L IAA培養基上培養60 d。每瓶接種3個莖尖，每個處理接種10瓶，培養條件同“1.2.1”。計算成活率、成苗率，并在電鏡下觀察脫毒效果。

1.2.3 催芽后高溫熱處理結合莖尖培養對脫毒效果影響的考察 取萊蕪大姜的姜塊，用經50%多菌靈800倍液浸泡處理的細沙鋪底和覆蓋，在室溫（25 ℃）下催芽，待芽長至0.5～1.0 cm時，洗潔精水清洗5 min，剝去外層葉子在自來水下沖洗30 min。在超凈工作臺上，用0.1%升汞溶液（加2～3滴吐溫 -20）消毒8～10 min，無菌水沖洗3～5次。置于60 ℃的高溫下分別處理15、30、45、60和75 min，再在無菌條件下切取約0.3 mm的莖尖分生點接種在MS+2.00 mg/L 6-BA +0.2 mg/L IAA培養基上培養60 d。每瓶接種3個莖尖，每個處理接種10瓶，培養條件同“1.2.1”。計算成活率、成苗率，并在電鏡下觀察脫毒效果。

1.2.4 脫毒效果鑒定 取脫毒處理后繁殖獲得的叢生芽嫩葉，在低溫下（-18 ℃）冷凍1 h，加1.5倍體積的0.1 mmol/L PBS（含2.5% 戊二醇，10%氯仿，pH 7.4）攪碎，勻漿2 min，雙層紗布過濾，濾液加10% 正丁醇，再勻漿1～2 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min。上清液加入6% PEG 6000和0.1 mmol/L NaCl充分溶解，10 000 r/min離心20 min。沉淀用0.2 mmol/L PBS 懸浮至4.0～6.0 mL。用細滴管吸取懸液，滴在載網上，2 min后吸取多余液體，加1滴（約10 μL）2% 磷鎢酸（pH 6.8）負染色2 min，室溫干燥后，電鏡（HITACH-7000）下觀察。每個樣品做3個銅網，每個銅網至少取20個不同視野檢測病毒，并與文獻[2]報道相對照，觀察脫毒效果。

1.2.5 繁殖生根同步化培養基篩選 將電鏡檢測后獲得的脫毒苗接種到培養基上擴繁后，以6-BA、NAA、ABT 3種激素的3個水平進行正交試驗L9（33），篩選脫毒姜的繁殖生根同步化培養基。每個處理10瓶，每瓶3個單芽，30 d后測試管苗平均生長率和芽增殖倍數，以平均生長率、芽增殖倍數和單株生根率為主要考察指標來篩選同步化培養基。平均生長率=（30 d后材料重-接種時材料重）/接種時材料重；芽增殖倍數=（30 d后芽數-接種時芽數）/接種時芽數。試驗因素水平見表1。

2 結果與分析

2.1 莖尖大小對脫毒效果的影響

病毒在植物體內通過維管組織遷移，由于分生組織尚未形成維管組織，一般不含病毒或只含少量病毒。因此，通過莖尖分生組織培養可以獲得無毒的姜試管苗（圖1）。莖尖大小對成活率、成苗率和脫毒率的影響結果見表2。從表2中可以看出，莖尖大小對成活率、成苗率和脫毒率均有影響。接種的莖尖越小，莖尖的成活率越低，但所獲得小苗的脫毒率卻越高，如莖尖大小為0.1 mm的處理組獲得的2株成活苗在電鏡下均未觀察到病毒粒子。但莖尖越小，培養后獲得的存活苗數也越少，且成活的莖尖不能分化，重新形成完整幼苗的可能性也越小。綜合上述各項因素，0.3 mm的莖尖能夠獲得較為理想的成活率、成苗率，并且具有較好的脫毒效果。

2.2 熱處理催芽結合莖尖培養對脫毒效果影響

熱處理催芽并結合莖尖培養對脫毒效果的影響見表3。由表3可知，與室溫催芽相比較，熱催芽處理對莖尖分生組織的成活率和成苗率的影響并不明顯，但熱催芽處理獲得的脫毒率高于對照組。較高的催芽溫度也會影響接種莖尖再生植株的能力，44 ℃處理組成活莖尖與莖尖成苗數量均低于另外2個熱處理組，且熱處理催發的芽一般顏色發白，芽的質量有所下降。

2.3 高溫熱處理結合莖尖培養對脫毒效果的影響

侵染姜的主要病毒為煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒。煙草花葉病毒是桿狀病毒，在90～93 ℃的高溫下處理10 min可將該病毒鈍化，但是這一溫度對細胞的殺傷力也比較大，一般植物細胞無法耐受如此高的溫度，因此在熱處理時一般不會采用這一溫度。黃瓜花葉病毒是一種球狀病毒，鈍化溫度為60～70 ℃，在此溫度下處理10 min即可將病毒鈍化，且短時間暴露在此溫度中不會對植物細胞造成過大的傷害，因此，本試驗中采用60 ℃作為高溫熱處理的溫度。

高溫熱處理結合莖尖培養法對成活率、成苗率和脫毒率的影響結果見表4。從表4可以看出，隨著熱處理的時間的增加，接種莖尖的成活率下降，表明暴露在高溫中的時間越長，細胞的存活能力越弱。雖然隨著高溫處理時間的增加，獲得的成苗數量下降，但成活苗的脫毒率上升，表明高溫鈍化部分病毒有助于提高脫毒效果。雖然高溫處理可以將部分病毒鈍化，但是高溫處理的時間不宜過長，一般在15～30 min為宜，高溫可使部分植物細胞死亡，甚至使剝取的莖尖無法成活。高溫處理的時間越長，莖尖死亡的數量也越多，能夠獲得的重生苗數量也越少，導致處理組的總體脫毒率下降。

2.4 繁殖生根同步化培養基篩選結果

脫病毒試管苗的繁殖生根同步化培養基篩選的正交試驗結果見表5。平均生長率結果表明，3種因素對平均生長率的影響順序是B（NAA）、A（6-BA）、C（ABT），其中NAA對平均生長率具有顯著影響，6-BA和ABT的影響較小。以平均生長率為指標篩選出的最佳培養基A3B3C3，即MS+2.50 mg/L 6-BA + 0.4 mg/L NAA +0.3 mg/L ABT。芽增殖倍數結果表明，3種因素對芽增殖倍數的影響順序是A（6-BA）、B（NAA）、C（ABT），其中6-BA對芽增殖倍數具有顯著影響，NAA對芽增殖倍數有影響，而ABT對芽的增殖影響不大。以芽增殖倍數為指標篩選出的最佳培養基為A3B3C2，即MS+2.50 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA +0.2 mg/L ABT。單株生根率結果表明，3種因素對單株生根率的影響順序是B（NAA）、C（ABT）、A（6-BA），但3種因素的影響均不顯著。以單株生根率為指標篩選出的最佳培養基為A3B3C3，即MS+2.50 mg/L 6-BA +0.4 mg/L NAA +0.3 mg/L ABT。

綜合以上因素，確定脫毒姜試管苗繁殖與同步化的適合培養基為MS+2.50 mg/L 6-BA +0.4 mg/L NAA+0.2～0.3 mg/L ABT。在繁殖生根同步化培養基上生長的姜試管苗比較粗壯，株高較高，葉片顏色較深，根系發達，適合直接移栽苗床。接種到正交試驗中9種培養基的試管苗均能獲得大量的叢生芽，且未分離成單株小苗前，各叢生芽束均長出根（圖2）。

3 小結與討論

植物病毒在體內是通過維管束系統和胞間連絲進行遷移的，而最主要的遷移途徑就是植物體內的維管系統，因為分生組織內沒有維管系統，病毒只能依靠胞間連絲進行移動，速度非常慢，難以追上分生組織活躍的生長速度，所以植物的莖尖分生組織一般沒有病毒或僅有少量病毒分布。而在莖尖分生組織培養脫毒的過程中，莖尖大小是影響植物脫毒是否成功的一個重要因素，因為莖尖過大，雖然容易培養獲得小苗，但病毒不易除去，無法達到脫毒的效果；而莖尖越小，病毒越容易除去，但越不易培養成活，也無法獲得無毒苗，影響脫毒效果[7]。

本研究中比較兩種熱處理法對脫毒效果的影響，發現采用熱處理法進行催芽時，熱處理對芽的傷害較小，芽的成活率和成苗率均高于高溫短時熱處理法。這是因為熱處理催芽是在熱處理后才選取健壯芽點，熱處理對芽的傷害作用在嫩芽選取時已經消除，而高溫短時熱處理是在對嫩芽消毒后進行，熱處理可能對芽造成殺傷作用或降低了芽尖的生命力，從而使得芽的成活率和成苗率均有所降低。但熱處理催芽所需時間較長，溫度保持對設施的要求較高、所需的經濟成本也較大，而高溫熱處理的時間較短，經濟成本相應降低，且在較短時間內進行熱處理獲得的脫毒效果也比較理想。因此，綜合考慮植物體內病毒的特性，采用短時間的高溫處理結合莖尖培養進行姜脫毒是較為理想的方法。

適合的姜脫毒苗同步化培養可以縮短培養周期，節省人力、物力，同時可獲得大量優質的適合移栽的脫毒試管苗。與繁殖培養基上生長的叢生芽相比較，同步化培養基上生長的試管苗比較粗壯，株高較高，葉片顏色較深，根系發達，適合直接移栽苗床。接種到正交試驗中9種培養基的試管苗均能獲得大量的叢生芽，且未分離成單株小苗前，各叢生芽束均長出根。在較高濃度的NAA和ABT組合時，根的數量較多，根長較為適中，根生長狀況良好，根系發達，分成單株后每株小苗平均有2～3個根，且根的長度約在3～4 cm，移栽苗床可以獲得較高的成活率，為脫毒姜苗的生產推廣提供技術依據。

參考文獻：

[1] 胡熙明，張文康，朱慶先，等.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1999.

[2] 范國強，郭興啟. 侵染姜的煙草花葉病毒的鑒定[J].山東農業大學學報（自然科學版）， 1999，30（3）：249-255.

[3] 任清盛，于廣霞，畢于義.姜脫毒及增產抗病性研究[J].中國植保導刊，2005（7）：8-10.

[4] 唐燕梅，李 全，陸 飛，等.生姜脫毒組培苗栽培技術[J].現代農業科技，2009（8）：42，45.

[5] 羅天寬，張小玲，唐 征，等.生姜脫毒苗成本分析及低成本生產技術研究[J].長江蔬菜，2007（1）：43-44.

[6] 蘭 平，李文鳳，朱水芳，等.熱處理結合莖尖培養去除甘薯叢枝病植原體[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2001， 29（3）：1-4.

[7] 唐克軒.中草藥生物技術[M].上海：復旦大學出版社，2005.