旱稻65及其雜交后代的RAPD分析

摘要：利用隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）從分子水平檢測旱稻65（Oryza.sativa L. cv. upland rice 65）及雜交后代間的遺傳差異。采用20對隨機引物對兩者基因組DNA進行RAPD-PCR擴增。結果表明，RAPD共擴增出159個位點，其中多態性位點有33個，占總位點的20.75%。旱稻65和雜交后代之間存在RAPD多態性，表明旱稻65和雜交后代之間DNA水平存在差異。

關鍵詞：旱稻65（Oryza.sativa L. cv. upland rice 65）；雜交后代；隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）；聚合酶鏈式反應式（PCR）

中圖分類號：S511.3+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4519-03

隨機擴增多態性DNA標記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術是建立在PCR（Polymerase chain reaction）基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態性分析的分子技術，廣泛應用于大豆（Glycine max）[1]、玉米（Zea mays）[2]、番茄（Solanum lycopersicum）[3]等生物的品種鑒定、系譜分析及進化關系的研究上。RAPD在旱稻研究中具有廣泛的應用，旱稻的種質資源鑒定、遺傳多樣性、遺傳改良研究等都與RAPD標記有關[4，5]。

旱稻是通過人工選擇培育而來可適應無水層土壤條件的生態型稻，具有耐旱性強、需水量少等特點，是進行作物抗旱遺傳改良的寶貴種質資源，是推行節水農業、旱作農業的最佳旱糧作物之一[6]。加強旱稻種質資源保護，挖掘抗旱基因資源，加快傳統旱稻品種的遺傳改良，對緩解當前水資源短缺具有重要意義。趙鳳梧等[7]通過將高光效、高抗性的C4植物稗草作為父本與旱稻65進行兩屬雜交，后代F5與高粱進行三屬雜交，得到穩定遺傳的后代。雜交后代光合效率及抗逆性狀均有明顯提高，并從同工酶及AFLP水平對試驗材料進行了研究，證實了后代中確有優良性狀基因的存在[8，9]。本研究選用旱稻65及旱稻/稗草//高粱的三系雜交后代（以下簡稱雜交后代）為材料，通過20對隨機引物分別對其基因組DNA進行RAPD分析，為旱稻種質鑒定及新品種選育等方面提供一定的分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

旱稻65及雜交后代種子由河北省農科院旱作農業研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物組織材料的培養 選取飽滿度一致的旱稻65及雜交后代種子各50多粒，0.1%氯化汞消毒10 min，蒸餾水沖洗5次，放于鋪有3層濾紙的培養皿中浸種發芽，待長至1周后選取幼嫩葉片進行基因組DNA提取。

1.2.2 基因組DNA的提取 旱稻65及雜交后代基因組DNA提取采用CTAB法[10]提取。

1.2.3 RAPD-PCR擴增 RAPD引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的隨機引物S1-S20。20 μL反應體系包括：10×PCR Buffer 2 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL， RAPD引物2 μL， DNA（30 ng）4 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/mL）1 μL，ddH2O補足至20 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，45個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。RAPD產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳， 溴化乙錠染色，紫外凝膠成像儀掃描觀察。

2 結果與分析

2.1 旱稻65及雜交后代基因組DNA檢測

通過瓊脂糖凝膠電泳對旱稻65及雜交后代基因組DNA進行檢測（圖1），所提取的基因組DNA條帶較清晰，很少有降解，符合RAPD擴增要求，可用于PCR分析。

2.2 旱稻65及雜交后代的RAPD分析結果

通過20對隨機引物對旱稻65及雜交后代進行RAPD分析（圖2、圖3）。由圖2、圖3可以看出，除了引物S2引物對雜交后代（S2-Z）未擴增出條帶，其余19對引物均對兩個品種擴增出不同長度的條帶，并且擴增片段大都分布在0.1～2.0 kb之間。同時在擴增的條帶中，除了S4、S7、S12、S17和S20引物對兩個品種的擴增條帶沒有明顯區別外，其余15對引物均可擴增出長度或亮度不一的特異條帶。

2.3 旱稻65及雜交后代的多態性位點

多態性的引物RAPD擴增共得到159條帶，其中多態性條帶33條，多態性程度為20.75%。每個引物可擴增出1～5條多態性條帶，平均多態性條帶為1.56。此外，不同隨機引物對旱稻65及雜交后代的擴增條帶有很大不同。由表1可知，引物S3、S8、S9、S10、S11，S15、S16的多態性條帶只有1條，引物S14、S18的多態性條帶有2條，而引物S2有5條多態性條帶。有些引物雖然擴增的總帶數多，但多態性條帶比例較少，如引物S4和S7基本沒有多態性條帶出現。有些引物雖擴增出的總帶數少，但多態性條帶比例較多，如引物S2擴增的總條帶數為5，但是多態性條帶比例可達100%。有些引物擴增出的總帶數和多態性條帶比例均較低，如引物S16擴增出的總帶數為5，多態性條帶比例只有20%。

3 小結與討論

利用RAPD技術對旱稻65及雜交后代進行分析發現，除了引物S2對雜交后代未擴增出任何條帶外，其他引物均可擴增出大小不一的特異條帶。從總的擴增水平來看，旱稻65及雜交后代呈現不同的擴增多態性，但兩者整體多態性偏低，多態性程度僅為20.75%。雜交后代是以旱稻65為母本進行多次雜交而產生，因此在基因組水平上可能存在很大的一致性，這也是導致兩者多態性偏低的重要原因。但從對兩者生理水平的研究發現，雜交后代在多個參數中均優于旱稻65。經過多次雜交后，雖然兩者在基因組水平上差異有限，卻可導致雜交后代生理上的優越性，表明通過雜交可以將稗草和高粱中的優良基因導入旱稻65中，最終產生了具有較好抗逆性的雜交后代。因此，可以將穩定的差異條帶進行克隆、鑒定及分析，篩選較好的抗逆基因，為轉基因研究奠定基礎。

同時發現，在統計多態性條帶時不能只以條帶的有無來判斷，實際上很多擴增條帶的強弱也可反映DNA水平的變化，同時也可作為差異來統計。由于RAPD標記是從分子水平上揭示種質間的遺傳差異，比傳統的遺傳標記準確度要高，因此，通過結合不同的分子標記方法，為選育雜交新品種提供一定的理論依據，為更好指導現代稻作育種提供便利。

參考文獻：

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