玉米白化突變體As—81647的鑒定及基因定位

摘 要：白化突變體As-81647是在自交系81647的自交后代中發現的自然突變體。光合色素含量測定表明，白化突變體葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量分別為正常植株的0.6%、5.8%和1.6%，推測光合色素含量的減少導致突變體光合作用強度減弱，無法利用光能進行營養生長，進而造成突變體產生白化表型，三葉期左右萎蔫死亡。組織細胞染色實驗證實H2O2的積累可能是造成突變體細胞死亡的直接原因之一。本研究構建了As-81647雜合突變體與蒙自2的雜交F2分離群體，遺傳分析表明該白化性狀由一對隱性核基因控制，暫時命名為As-81647（Albino seeding-81647）。利用已公布的SSR分子標記和本實驗室開發的分子標記，將該基因定位在玉米第3染色體umc1052和umc1641之間，遺傳距離分別為0.7 cM和 2.8 cM 且與分子標記as47共分離。

關鍵詞：玉米（Zea mays L.）；白化突變體；基因定位

中圖分類號：S513.032 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）10-0012-04

高等植物中，植株葉色突變比較常見，該類突變體是研究植物光合作用、光形態建成等的理想材料^[1～6]。此外，葉色突變極易識別，可作為標記性狀應用于良種選育^[7]和雜交育種^[8]中。Gustafsson根據突變體苗期的葉色差異將葉色突變分為白化、黃化、淡綠、條紋和斑點五種類型^[9]。其中，白化致死突變是葉綠素缺失突變體中缺失最徹底、最嚴重的一類，這種極端表型的突變體在機理研究方面具有更為重要的利用價值。目前在擬南芥^[10]、玉米^[11]、水稻^[12，13]、煙草^[14]等植物中均有白化突變體的報道。玉米突變體庫MaizeGDB報道的177個葉色突變基因中，白化基因16個，黃白葉基因12個，這些基因的研究進展不一致，有些已定位到很小的區域，有些只初步定位到特定染色體上。16個白化基因及染色體定位結果為：w*-018-3（1）、w*-021-7（5）、w*-062-3（3）、w*-6577（1.06）、w*-8345（1.05）、w*-8889（9.03）、w*-8950（9）、w*-8954（6）、w*-9000（9.01）、w*-9005（4）、w20 white（1.05）、w24 white（1.06）、ij1 iojap striping1（7.03）、blh*-N2359（8.04）和blh*-N487C（1）； 12個黃白葉基因及染色體定位結果為：yg*-N2448（1.02）、v*-N308（5.05）、wl*-N1803（9）、wl*-N1982（8.05）、wl*-N311B（4.06）、wl*-N362B（6.02）、wl*-N4（3.05）、wl*-N44（5）、wl*-N47（1.06）、wl*-N56（1.06）、wl*-N60（1.06）、wlu7（1.05）和wlu9（5.05）。

本研究從玉米自交系81647中發現了白化突變體As-81647，此突變體從出苗到二葉或三葉期萎蔫死亡期間所有葉片均是白色，與我們之前報道的來源相同的黃化致死突變體nec-t^[15]表型明顯不同。本研究的主要目的是初步明確白化基因As-81647的遺傳特點，確定其在染色體上的位置，為進一步研究白化突變體形成的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實驗室選育的含白化突變基因的自交系81647（As-81647雜合突變體）和正常自交系蒙自2。

1.2 光合色素提取及含量的測定

1.2.1 光合色素的提取 利用95%乙醇離體法萃取二至三葉期玉米葉片光合色素^[16]。

1.2.2 光合色素含量的測定 利用紫外可見分光光度計UV-2450分別測量提取液在波長665、649 nm和470 nm 下的吸光度。根據Lichtenthaler修正公式^[17]計算各光合色素的含量。

1.3 組織細胞染色

1.3.1 臺盼藍（Trypan blue）染色 將植株葉片浸泡在臺盼藍溶液中（每1 ml乳酚中溶解2.5 mg 臺盼藍粉末），沸水浴染色10 min，室溫染色12 h，水合氯醛（2.5 g/ml）中脫色3～4 d 。解剖鏡（Olympus， SZX12）下觀察、照相。

1.3.2 二氨基聯苯胺（Diamino benzidine， DAB）染色 將DAB溶于蒸餾水中，使終濃度為1 mg/ml，鹽酸調pH至3.8。剪取長度為5 cm 的葉片，浸透于DAB溶液中，光照培養箱反應8 h。剪取中間3 cm 置于75%酒精中煮沸，脫色。解剖鏡（Olympus， SZX12）下觀察、照相。

1.4 遺傳分離群體的構建

利用AS-81647雜合突變體作父本與蒙自2配置雜交組合，用自交能分離出白化突變體的對應單株進行F1自交，獲得F2分離群體，用于玉米白化性狀的遺傳分析和白化基因定位。

1.5 基因組DNA提取與基因定位

1.5.1 基因組DNA提取 將獲得的F2群體種植于山東農業大學農學試驗站，于二葉期選取幼嫩葉片，采用SDS法提取基因組DNA^[18]。

1.5.2 白化基因As-81647的連鎖分析 采用BSA法篩選與突變基因連鎖的分子標記^[19]，所用PCR反應體系（10 μl）為： 10×Easy Taq Buffer（+Mg2+）1.0 μl、dNTPs（2.5 mmol/L ）0.2 μl、引物（10 μmol/L ） 1.0 μl、模板DNA（20～50 ng/μl） 1.0 μl、Taq酶（5 U/μl ）0.1 μl、ddH2O 6.7 μl。反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，57℃ 30 s，72℃ 50 s，36個循環；72℃ 10 min。利用獲得的多態性分子標記鑒定F2代植株并記錄單株表型（白化或正常）。采用Kosambi函數將重組率轉化為遺傳距離，使用MapDraw軟件繪制連鎖圖譜。

2 結果與分析

2.1 白化突變體As-81647的發現和表型特征

在玉米自交系81647中發現葉色白化突變體As-81647，培養箱或大田種植，突變體幼苗都表現為白色，二葉或三葉期萎蔫死亡，整個生長期間除所有葉片表現為白色外，其他表型特征與正常植株無明顯區別（圖1）。由于純合突變體無法進行生殖生長，該突變性狀依靠雜合體遺傳給后代。

2.2 白化突變株與正常植株光合色素含量差異

白化突變植株葉片光合色素含量均顯著低于正常植株（表1），推測光合色素的缺失可能是導致突變體呈現白化性狀的直接原因。一方面，突變體葉綠素含量極少，葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素含量分別為正常植株的0.6%、5.8%和1.6%，幾乎不能利用光能進行營養生長，只能依靠胚乳提供的營養物質，待胚乳養分消耗殆盡，突變體隨之死亡，突變體胚乳大小可能決定其萎蔫死亡的早晚；另一方面，突變體葉綠素a/b約為正常植株的1/10，遠遠低于正常水平，葉綠素a/b的值反映了植物的光能利用率，說明突變體的光能利用率也低于正常水平。

2.3 正常植株及突變體葉片的組織細胞染色

為進一步明確白化突變體死亡的原因，對突變體和正常植株葉片（三葉期）進行了組織細胞染色。

2.3.1 臺盼藍染色 植物細胞損傷或死亡時，細胞膜通透性增強，臺盼藍可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA 結合，使其著色；而正常的活細胞，胞膜結構完整，能阻止染料進入細胞，從而不會被臺盼藍染色，根據顏色差異可直接區分正常與死亡細胞。臺盼藍染色結果如圖2所示，白化突變體葉片被染成深藍色，整個葉片染色較均勻，而正常植株未被染成藍色，表明該時期突變體葉片內部細胞已經死亡或在死亡進程中。

2.3.2 DAB染色 植物體可通過葉綠體、線粒體、過氧化物酶體等細胞器產生活性氧。活性氧具有較高化學毒性，低濃度活性氧能夠引起植物防御，高濃度活性氧則能夠造成植物細胞死亡。正常植株通過一系列代謝清除機制能夠將活性氧濃度維持在正常水平，若代謝發生障礙則會造成活性氧的積累，從而造成植物體細胞損傷。DAB能與H2O2在過氧化物酶的催化作用下反應生成褐色沉淀物，可用于檢測H2O2的產生及積累部位。DAB染色結果如圖3所示，正常植株未見褐色沉淀，而白化突變體的整個葉片被染成褐色，說明白化突變體細胞死亡過程中整個葉片均有H2O2的積累。H2O2的積累可能是導致白化突變體細胞死亡的直接原因之一。

2.4 白化突變體遺傳分析

為探討該白化性狀的遺傳方式，將蒙自2與As-81647雜合突變體雜交，所得F1代植株葉片顏色均表現為綠色。F1自交得到F2，首先鑒定出F2中分離的果穗，從出現分離的果穗中挑選5個在大田種植鑒定其分離比（表2），卡方檢驗結果表明正常植株與白化植株呈現3∶1的分離比例，表明該白化突變表型受一對隱性核基因控制，暫命名為As-81647。

2.5 白化基因As-81647的定位

從玉米數據庫中（http：//www.maizegdb.org）挑選308對均勻分布在玉米10條染色體上的SSR引物，在兩親本間共檢測到76對多態性標記。利用BSA法構建正常基因池和白化突變基因池進一步篩選，得到10個多態性標記。連鎖分析表明位于第3條染色體上的SSR標記umc1594（bin3.09）可能與目的基因連鎖。利用496株F2代白化突變株驗證，共出現84株交換單株，進一步證明umc1594（bin3.09）與目的基因是連鎖的，遺傳距離為16.9 cM 。利用SSRHunter、Primer Premier5.0軟件在bin3.09區域開發出54對SSR標記，加上bin3.09區域25對公共SSR標記，對分離群體進行了連鎖分析，最終將目標基因定位于umc1052和umc1641之間，遺傳距離分別為0.7 cM 和2.8 cM ，且與as47共分離（as47所在BAC文庫為AC212477.3，引物序列：正：AACCCCATCTTGCTCGTA，反：TCGCCATTCTGTAAAGTCC）。利用MapDraw軟件繪制連鎖圖（圖4）。

3 討論

白化突變體As-81647與黃化類病變突變體nec-t都屬于自然葉色突變，遺傳分析表明兩突變都是受一對隱性核基因控制，開始我們認為As-81647是nec-t突變的一種類型，通過進一步研究將As-81647定位在bin3.09區域，與nec-t突變基因定位區間明顯不同，證明兩突變基因并非等位基因。由于自然界中葉色突變時有發生，推測兩基因在突變進程上可能并無太大關聯，只是同宗親本在不同方向上的突變。

MaizeGDB報道的28個表型相同或相近的突變基因均與白化基因As-81647處于不同位點且多數定位范圍較籠統。其中，黃白葉突變基因wl*-N4定位在bin3.05區域，與As-81647定位區間不同，兩突變體表型也略有差異，推斷兩突變基因為非等位基因；白化突變基因w*-062-3雖與As-81647定位在相同染色體上，但w*-062-3目前研究較少，無具體定位區間的報道，難以證明與As-81647基因是否等位，為判斷As-81647是否是新的突變基因需要與w*-062-3進行進一步的等位性分析。此外，As-81647基因定位區間內尚有共分離的SSR標記，有待于進一步擴大群體縮小定位區間，并進一步克隆該基因，為探討葉綠素合成過程及白化機理奠定基礎。

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