小立碗蘚細胞色素P450基因PpCYP51G1的分離及轉化載體構建

摘 要：從小立碗蘚（Physcomitrella patens）中克隆了細胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1的全長編碼序列，編碼區長1 509 bp，預測編碼488個氨基酸，蛋白二級結構含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋，N端含有一個跨膜區域。構建了PpCYP51G1的功能缺失載體，并利用PEG介導的原生質體轉化技術獲得該基因的功能缺失轉化體；同時，構建了PpCYP51G1-GFP融合蛋白載體，亞細胞定位結果表明，PpCYP51G1定位在內質網中。

關鍵詞：小立碗蘚；細胞色素P450；CYP51；克隆；轉化載體構建

中圖分類號：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）10-0001-07

CYP51為甾醇14α-去甲基化酶（又稱P45014DM），被視為最古老的細胞色素P450家族成員^[1]，是細胞色素P450家族中唯一一個在真菌、植物和動物界都具有保守功能的成員^[2]。真菌CYP51是真菌麥角甾醇合成過程的關鍵酶，抑制其活性將會阻礙麥角甾醇的合成，破壞細胞膜的結構和功能，最終導致真菌死亡。目前農業上CYP51抑制劑（14α-demethylation inhibitors，DMIs）類殺菌劑即是通過抑制真菌CYP51的活性發揮殺菌抑菌作用^[3]。植物CYP51不僅參與植物體的基礎代謝，還參與植物體的次生代謝，主要表現在次生代謝物質的合成及降解化學藥物毒性兩方面，其催化的代謝途徑可產生一些重要次生代謝物， 提高植物抵抗病蟲害及逆境脅迫的能力^[4]。因此，研究CYP51對于研究細胞色素P450的結構、功能和進化具有重要意義。

小立碗蘚（Physcomitrella patens）是目前發現的唯一具有高頻率同源重組的植物^[5]。同源重組是基因打靶的技術核心。Kammerer^[6]和Cove^[7]等首先在小立碗蘚中實現了基因同源重組。隨后Schaefer等^[8，9]進一步證實小立碗蘚基因打靶效率高達90%，與酵母基因打靶頻率（95%）相當，這是高等植物中通過同源重組進行精確基因打靶的先例。……