西達本胺聯合順鉑對三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231的體外抗增殖作用及其機制的研究

項丹，姜藻，顧曉怡

(1.東南大學附屬中大醫院腫瘤中心，江蘇南京 210009;2.東南大學環境醫學工程教育部重點實驗室，江蘇南京 210009)

近年來乳腺癌發生率呈明顯上升趨勢，其中不表達雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和表皮生長因子受體-2(HER-2)的乳腺癌被稱為“三陰性”乳腺癌［1-2］，是目前乳腺癌治療的難點之一［3-4］。Basal-like型細胞絕大多數不表達這3種受體，因此常作為研究“三陰性”乳腺癌的靶細胞［5］。目前的研究結果僅能提示鉑類、蒽環類、高劑量環磷酰胺等可能是相對敏感藥物［6］，而紫杉類和長春新堿類藥物是不敏感藥物，但不能明確三陰乳腺癌的最佳治療策略［6-7］。

西達本胺是我國自主研發的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，目前研究表明其可抑制結腸癌、前列腺癌、淋巴瘤等細胞的增殖，但其對三陰乳腺癌的作用尚未見報道。本實驗通過西達本胺和(或)順鉑(DDP)干預Basal-like型細胞，初步探討西達本胺聯合順鉑體外干預三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖、凋亡及其機制，探索治療三陰乳腺癌的新方法。

1 材料和方法

1.1 細胞

人三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231購于中國科學院細胞庫，培養傳代在含體積分數為10%新生牛血清的DMEM高糖培養基、CO2體積分數為5%的培養箱中，選擇對數生長期細胞進行實驗。

1.2 藥物及主要試劑

順鉑購自山東齊魯制藥廠，西達本胺由深圳微芯公司贈送，用二甲亞砜(DMSO)溶解，配成32 000 μmol·L-1的儲存液，保存于-20℃冰箱中，3周內使用，控制DMSO濃度在1%以內。DMEM培養液(美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青有限公司)，HEPES、DMSO、MTT(美國 Sigma 公司)，Anti-ERCC1 antibody、Anti-HDAC3 antibody、Anti-Histone H3 antibody-ChIP Grade(美國Abcam公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法檢測西達本胺及順鉑單獨對MDA-MB-231細胞增殖的影響 將MDA-MB-231細胞密度調整為4.5 ×104ml-1，接種于96 孔培養板，每孔200 μl，培養過夜，觀察細胞貼壁且生長良好后，取西達本胺藥物濃度 4、8、16、32、64、128 μmol·L-1，DDP 藥物質量濃度 1、2、4、8、16、32 mg·L-1處理作為實驗組，非藥物處理作為陰性對照，DMEM培養液不加細胞作為空白對照，各設3個復孔，分別繼續培養24、48、72 h，每孔加入 5 mg·ml-1MTT 溶液 20 μl，培養 4 h，吸棄培養液，每孔加 DMSO 150 μl，搖床振蕩 5 min，酶標儀測定492 nm波長處OD值。以藥物作用濃度為橫坐標、抑制率為縱坐標繪制腫瘤增殖抑制曲線圖，并計算出IC50值。

1.3.2 MTT法檢測西達本胺及順鉑聯合對MDA-MB-231細胞增殖的影響 以1/2 IC50西達本胺+1/16、1/8、1/4、1/2、1、2 IC50順鉑作用于細胞，并計算出達到IC50時順鉑的濃度。

1.3.3 流式細胞儀(FCM)檢測西達本胺對MDA-MB-231細胞凋亡的影響 將MDA-MB-231細胞密度調整為4.5×104ml-1，接種于6孔板，每孔4 ml，分別以1/4 IC50、1/2 IC50和IC50濃度的西達本胺處理細胞48 h，對照組加入含等量DMSO的DMEM培養液，用不含EDTA的胰酶消化收集處理后的MDA-MB-231細胞，4℃PBS緩沖液洗滌2次，加入500 μl結合緩沖液、5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI，染色 5 ～15 min 后，用流式細胞儀及ModFit軟件檢測分析。

1.3.4 Western blotting分析組蛋白H3、HDAC3蛋白的表達 取生長狀態良好的細胞，待細胞密度達到60%～70%，分別取IC50西達本胺、1/2 IC50西達本胺處理及對照組細胞各5×106個，加裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解 30 min，14 000 r·min-1離心 5 min，取上清，BCA法測定蛋白含量。蛋白與5倍上樣緩沖液混合煮沸5 min后，取20 μg蛋白上樣，進行SDSPAGE，轉膜并封存。50 g·L-1的脫脂奶粉/TBST按1∶1 000稀釋一抗，4℃孵育過夜，再加入HRP標記的相應二抗4℃孵育2 h，然后加入ECL液，曝光，顯影，定影。

1.3.5 熒光定量PCR檢測ERCC1基因表達情況分別取IC50西達本胺、IC50順鉑及1/2 IC50西達本胺+1/2 IC50順鉑處理48 h及對照組細胞5×106個，采用Trizol法提取細胞中總RNA，用TaKaRa逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用羅氏SYBR染料進行熒光定量PCR，行數據分析。PCR反應條件為:95℃預變性10 min;94℃變性15 s，54℃或者58℃退火20 s，72℃延伸30 s，共循環40次。ERCC1上下游引物分別為5'-TGGCTTCTGCTATGTCAACG-3'和5'-GCACGTGGGTTG GTAGAAGT-3'，產物大小為216 bp;內參β-actin上下游引物分別為5'-AGATACTAATGCTCTGCGTGT-3'和5'-GATGGAGACTGGCTTCTGATT-3'，產物大小為 147 bp。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 西達本胺、順鉑單藥對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用

與未經藥物處理的正常對照組比較，細胞經過不同濃度不同時間的處理后細胞增殖受到明顯抑制，不同濃度及不同時間細胞增殖存在明顯差異(P＜0.05)，見圖1、2。西達本胺作用24、48、72 h 的 IC50分別是(84.36 ±4.33)、(57.38 ±7.19)、(31.64 ±9.25)μmol·L-1，順鉑作用24、48、72 h 的IC50分別是(18.24 ±1.14)、(8.37 ±0.79)、(5.08 ±1.63)mg·L-1。單藥西達本胺濃度64 μmol·L-1、單藥順鉑質量濃度 8 mg·L-1接近 48 h的IC50值，遂取其為后續實驗濃度。

圖1 西達本胺對MDA-MB-231細胞增殖的影響Fig 1 Influence of chidamide on the proliferation of MDAMB-231 cells

圖2 順鉑對MDA-MB-231細胞增殖的影響Fig 2 Influence of cisplatin on the proliferation of MDA-MB-231 cells

2.2 西達本胺聯合順鉑對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用

32 μmol·L-1西達本胺聯合不同濃度的順鉑(0.5、1、2、4、8、16 mg·L-1)對 MDA-MB-231 細胞作用48 h后，抑制率分別為(23.04±4.73)%、(37.45±5.14)%、(49.47±3.72)%、(60.33±4.05)%、(76.64±3.58)%、(89.14±6.12)%，計算出順鉑的 IC50為(1.97±0.24)mg·L-1，此數值明顯小于 1/2 IC50順鉑，表明西達本胺聯合順鉑能起到協同作用。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

西達本胺作用48 h后，16 μmol·L-1組細胞凋亡率為48.5%，32 μmol·L-1組凋亡率為 70.1%，64 μmol·L-1組凋亡率為89.9%，而對照組細胞自然凋亡率為16.4%，說明該藥物具有明顯的促細胞凋亡作用。3個濃度西達本胺組間差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 西達本胺作用MDA-MB-231細胞48 h的細胞凋亡Fig 3 Apoptosis of MDA-MB-231 cells treated with chidamide for 48 h

2.4 不同濃度西達本胺對組蛋白H3、HDAC3蛋白表達的影響

Western blotting 法檢測顯示，對照組和 32、64 μmol·L-1西達本胺作用48 h后隨著藥物濃度的增加，H3的乙酰化水平增強，HDAC3蛋白表達減少，見圖4。表明西達本胺可通過抑制HDAC3蛋白的表達，上調組蛋白H3的乙酰化水平，影響相關基因的轉錄，從而抑制腫瘤細胞的增殖。

圖4 西達本胺作用48 h后H3、HDAC3蛋白表達水平Fig 4 The expression of H3 and HDAC3 of MDA-MB-231 cells treated with chidamide for 48 h

2.5 熒光定量PCR檢測ERCC1基因表達情況

熒光定量PCR結果顯示，單獨使用順鉑組細胞ERCC1與對照組表達量相近，但單獨使用西達本胺組細胞ERCC1較對照組表達量有明顯減少，聯合用藥組細胞ERCC1較空白對照組表達量亦明顯減少，表明西達本胺能降低細胞ERCC1的表達量，從而降低細胞對順鉑的耐藥性，達到協同作用，見圖5。

圖5 西達本胺和(或)順鉑作用48 h后細胞ERCC1的相對表達量Fig 5 Expression level of ERCCI of MDA-MB-231 cells treated with chidamide and(or)cisplatin for 48 h

3 討 論

組蛋白去乙酰化酶抑制劑會使染色質組蛋白乙酰化水平增高，改變染色體結構，影響基因的轉錄，從而抑制細胞的增殖和誘導凋亡［8］。目前報道的已進入臨床或即將進入臨床試驗的組蛋白去乙酰化酶抑制劑共有十余個，西達本胺是我國自主研發合成的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑［9］，其活性基團為苯酰胺基，底物主要為HDAC3［10］。目前研究發現，其可抑制惡性黑色素瘤細胞［11］、前列腺癌細胞［12］、結腸癌細胞［13］、B 淋巴瘤細胞［14］、胃癌細胞［15］的增殖，但未見西達本胺作用于三陰乳腺癌的相關報道。順鉑是一種類烷化劑的金屬鉑類化合物，三陰乳腺癌對鉑類藥物相當敏感。本研究首次進行了西達本胺單藥或(和)順鉑體外治療三陰乳腺癌的研究。

MTT結果表明，西達本胺和順鉑單藥對MDAMB-231細胞的生長均有抑制作用，且抑制率隨著藥物劑量及時間的增加而增加，具有劑量時間效應依賴關系。兩藥聯合作用后對乳腺癌細胞相同的抑制作用時所需藥物劑量較其單獨作用時極大降低，這對于臨床用藥時降低藥物劑量、減少毒副作用具有極大的意義。

HDACI可以抑制腫瘤細胞內高表達的HDAC活性。相關研究發現，西達本胺可抑制HDAC1、2、3和10的活性［16］。本實驗結果發現，HDAC3在MDA-MB-231細胞中有表達，且西達本胺能降低HDAC3在此細胞株中的表達。西達本胺抑制HDAC3后可上調組蛋白H3的乙酰化水平，誘導細胞周期阻滯和凋亡，進一步抑制腫瘤細胞的增殖［17］。本實驗發現，應用西達本胺后與空白組對照，組蛋白H3的乙酰化水平有所提高。因此，在表觀遺傳方面顯示，西達本胺上調組蛋白H3的乙酰化水平，影響相關基因的轉錄，從而抑制腫瘤細胞的增殖。

順鉑對腫瘤的細胞毒作用主要是通過形成鉑-DNA加合物。順鉑的主要作用靶點是DNA，順鉑進入腫瘤細胞后水解為雙氯雙氨鉑，然后與細胞DNA形成順鉑—DNA加合物，影響細胞DNA的復制與轉錄，從而導致DNA損傷，使增殖的細胞停滯在G2/M期［18］。ERCC1對鉑類藥物化療及其患者生存期具有顯著相關性［19］，ERCC1過表達可使停滯在 G2/M期的損傷DNA迅速修復，尤其是ERCC1能使順鉑誘導的DNA絡合物的清除增加，導致其對順鉑耐藥［20］。本實驗結果顯示，西達本胺聯合順鉑較單藥順鉑ERCC1的表達降低。因此，西達本胺能降低ERCC1的表達是兩藥聯合增效的部分原因。

本實驗的意義在于，首次發現西達本胺聯合順鉑在體外能協同抑制MDA-MB-231細胞的增殖，并初步闡明其分子機制，為該方案的臨床應用提供了理論依據。

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