蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測研究

張陣陣 欒 潔 汪家春 儲智勇

海軍醫學研究所，上海 200433

蟲草屬Cordyceps （Fr.）Link 是一大類昆蟲病原真菌，其特定的菌感染特定的昆蟲后才成為具有重要的藥用價值的冬蟲夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]，該屬偽品種類繁多，品質高低各異[1]。 蟲草屬的種質資源豐富，屬間物種的形態極其相似， 但僅有蝙蝠蛾科蟲草為 《中國藥典》2010 年版規定的冬蟲夏草。 現代藥理藥效學研究顯示，蝙蝠蛾科蟲草對吞噬腫瘤細胞的能力是硒的4 倍，所含的蟲草素能明顯增強紅細胞黏附腫瘤細胞的能力，抑制腫瘤生長和轉移，明顯提升白細胞和血小板的數量，可輔助治療鼻咽癌、肺癌、白血病、腦癌等惡性腫瘤；減輕組織水腫，可多用于腦水腫的輔助治療， 防治急性腎功能衰竭等疾病，預防和控制慢性支氣管炎、肺源性心臟病，迅速改善放、化療后的嘔吐惡心、頭發脫落、失眠等癥狀。 另外，蝙蝠蛾科蟲草所含的特有成分蟲草多糖為免疫調節劑，臨床治療及保健用途廣泛。 在美國，因其對于惡性腫瘤預防控制的特殊貢獻，已將其列為抗腫瘤新藥，目前已進入臨床三期的研究[2-3]。

因受自然條件的限制，天然蝙蝠蛾科蟲草資源日益緊缺，價格昂貴，一些不法分子利用劣質或亞香棒蟲草代替蝙蝠蛾科蟲草， 其治療效果受到偽品及劣質品嚴重影響，甚至對人體產生毒副作用，鑒別和評價同屬不同科的蟲草顯得尤為重要[4]。 目前，其檢測方法多為生藥學鑒定，薄層色譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳法等主要化學方法鑒定，分子水平鑒定也開始進行[5-8]。

藥用真菌蟲草屬的DNA 指紋圖譜檢測方法中所采用的放射顯帶方法和熒光顯帶方法具有一定的局限性，放射顯帶方法對環境和實驗人員均有高污染的風險，而熒光顯帶方法所需要的儀器昂貴，難以普及。 另外，低污染而應用普遍的傳統聚丙烯凝膠電泳銀染顯帶方法操作時間長、步驟多，采用試劑繁多，易造成顯帶背景顏色濃、分辨率低、條帶模糊的情況，導致顯帶結果不準確。本文分別對蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠終濃度、膠電泳步驟、膠固定方案、膠染色方法、膠顯色步驟進行分析，確定利于蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠DNA 多態性展現的方案， 現報道如下：

1 材料與儀器

1.1 材料

蟲草屬Cordyceps（Fr.）Link 樣品由海軍醫學研究所汪家春副研究員鑒定。 丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、過硫酸胺、TEMED 購自Takara 生物公司；尿素（Urea）購自Sigma 公司；硝酸銀、剝離硅烷、親和硅烷購自北京鼎國生物工程公司；引物、接頭由上海生物工程技術服務有限公司完成；其余試劑均為國產分析純。

表1 不同濃度聚丙烯酰胺凝膠配制情況

1.2 儀器

DYCZ-20A 型電泳槽、DYY-12 型電泳儀電源（北京六一儀器廠），P270 型搖床 （中國科學院武漢科學儀器廠），PCR 儀 （德國Biometra 公司），DK-S12 型電熱恒溫水浴鍋（上海華連醫療器械有限公司），高速離心機（德國Eppendorf 公司），PL3002 型電子天平（METTLER TOLEDO 公司）。

2 方法

2.1 配制緩沖液及常用試劑

2.1.1 TE 緩沖液的配制 用pH 8.0 為10 mmol/L Tris-HCl及1 mmol/L EDTA 配制，配制溶液高壓滅菌后室溫保存。

2.1.2 5×TBE 緩沖液的配制 在800 mL 雙蒸水中加入Tris、硼酸和pH 為8.0 的EDTA，定容至1 L 后室溫保存。

2.1.3 1 mmol/L Tris-HCl 的配制 在雙蒸水中加入Tris-HCl，雙蒸水取800 mL，用濃HCL 的劑量調節pH 值，定容至1 L 后室溫保存。

2.1.4 5 mol/L EDTA 的配制 稱取186.1 g 乙二胺四乙酸二鈉鹽·2H2O 溶于800 mL 雙蒸水， 用NaOH 的劑量調節pH 值，調至pH 8.0，定容至1L 后室溫保存。

2.1.5 變性上樣緩沖液的配制 在98 mL 去離子甲酰胺溶液中加入2 mL EDTA 溶液，EDTA 溶液為pH 8.0， 再分別加入50 mg 溴酚蘭和50 mg 二甲苯氰。

2.1.6 40%丙烯酰胺儲液（19∶1）的配制 50 mL H2O 中加入丙烯酰胺和2 g N，N′-亞甲叉雙丙烯酰胺， 加熱到37℃使之溶解，用定性濾紙過濾定容至1 L 后，棕色瓶里4℃保存。

2.1.7 顯影液及染色液的配制 將60 g 碳酸鈉加入2 L 的雙蒸水中，放入冰箱4℃保存，在顯色時即刻加入甲醛溶液和硫代硫酸鈉溶液，震蕩均勻后配制成顯色液；在1 L 的雙蒸水中加入硝酸銀和甲醛溶液，充分溶解后配制成染色液。

2.1.8 不同比例硝酸銀溶液的配制 1 L 所配制的染色液中分別加入1、2、3、4 g 的硝酸銀，配制成濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的溶液。

2.2 測序凝膠板的制備

分別用親和硅烷溶液和浸透剝離硅烷處理相應的測序凝膠板，建立黏附和分離功能的測序凝膠板。

2.3 凝膠的制備

先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入丙烯酰胺和N，N’-亞甲叉雙丙烯酰胺混合溶液 （Acr&Bis） 溶液和10×硼酸（TBE）緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2 mL，并用0.45 mm的濾膜過濾， 然后再加過硫酸銨和四甲基乙二胺（TEMED）。 表1 為配制3%～6%不同聚丙烯酰胺凝膠濃度所 需 尿 素、Acr&Bis、10×TBE 緩 沖 液、10%過 硫 酸 銨、TEMED、雙蒸水的配方。

2.4 測序凝膠銀染顯色步驟

2.4.1 膠固定 將聚丙烯酰胺凝膠板放入容器中，用配制號的固定溶液浸沒，用搖床振蕩至標記樣品的染色帶小時。

2.4.2 膠染色 將固定好的聚丙烯酰胺凝膠分離，對出現分子指紋顯色的聚丙烯酰胺凝膠板進行漂洗， 時間控制在6 s以內，漂洗好后即刻放入配好的染色液中進行染色，搖床充分震蕩15 min。

2.4.3 膠清洗 用雙蒸水充分清洗， 具體方法為振蕩洗膠3次，每次5 min。

2.4.4 膠染色終止 終止顯色反應，將聚丙烯酰胺凝膠放入終止液中，固定凝膠并干膠。

3 結果

3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染結果

聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%時， 分子遷移率和多態性均符合蟲草屬分子的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測需要，見圖1。銀染中膠顯色步驟中顯影液為強堿NaOH 和0.5%的甲醛溶液，且NaOH 的濃度為2%。

圖1 部分蟲草屬樣品6%聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染圖

3.2 不同Ag+濃度對蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺電泳多態性顯示的影響

由表2 可見，蟲草屬DNA 在0.3%Ag+濃度的聚丙烯酰胺凝膠多態性最佳，多態性條帶數達到80 以上，且染色背景清晰。

表2 不同Ag+濃度對蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺電泳多態性顯示的影響

表3 常見幾種方法對蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺電泳多態性顯示的影響

3.3 常見幾種方法對蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺電泳多態性顯示的影響

由表3 可見， 蟲草屬DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測采用方法3，即固定、染色、顯色三步時聚丙烯酰胺凝膠多態性顯示最佳，且節約染色時間，操作及保存方式簡單。

4 討論

中藥材的真假、質量的好壞，會直接影響臨床應用的效果和患者的生命安全，對此，李時珍早就有“一物有謬，便性命及之”的名言。 所以對于中藥材的鑒別有著十分重要的意義。 中藥材的鑒別方法有很多，通常可分為對植物自然形態的鑒別，對炮制藥材外表性狀的鑒別，用顯微鏡觀察微觀結構的鑒別，以及化學分析、生物測定等鑒別方法。 近年對中藥質量的評價方法進展很快，有用藥效學、免疫活性以及化學模式識別結合藥效學、DNA 指紋圖譜等方法評價中藥的質量[9]。 DNA 指紋圖譜技術是以生物基因組DNA 序列多樣性為基礎，研究不同物種間遺傳差異的一項技術。 生物在長期進化過程中由于各種原因，在基因組水平上產生了廣泛的變異，在物種間甚至個體間產生了高度多態性， 這種多態性不因組織器官和個體發育而改變，可以通過對相應位點或片斷的考查檢出，通過多態性圖譜的形式表現出來。 我國中藥產業化、規范化、標準化是中藥現代化的必由之路，中藥材品質鑒定是中藥質量控制的首要環節，尋找科學有效的鑒定方法是實現中藥現代化迫切任務。 特別是近年來藥用蟲草的研究和應用很廣，受利益驅使，一些不法分子利用劣質或亞香棒蟲草代替蝙蝠蛾科蟲草，因此對蟲草屬的鑒別和品質鑒定尤顯重要[10-12]。

本文所采取的蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法所采取的銀染法，是利用銀離子可與核苷酸結合的特性，甲醛能使銀離子在堿性環境下還原，從而顯現蟲草屬聚丙烯酰胺凝膠中的DNA 指紋片段。 與同位素檢測顯帶相比較，其靈敏度雖低于同位素，但完全可達到檢測要求，避免了同位素的危害。 聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染顯色既可避免接觸誘變劑（溴化乙錠），也可免受同位素的輻射，實用性強[13]。與熒光染色檢測方法相比，解決了熒光染色檢測方法費用高額的矛盾，易推廣普及。 另外，與傳統的四步法（固定、染色、顯色、終止）相比較，節省了時間，提高了效率；同時，與二步法（合并固定于染色為一個步驟的方法）相比較，該方法能檢測到蟲草屬小分子量的多態性，得到了高分辨率的蟲草屬DNA 指紋。 因此，各個物種分子多態性分布不同，需要進行特定性條件的摸索，以建立適合的聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染條件和方法。

蟲草屬分子聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法具體實驗操作中還有以下體會： ①凝膠測序板的制備需要單向處理，不可擦拭太過用力，否則會導致玻璃硅烷蒸發，造成聚丙烯酰胺凝膠脫落于測序版；制備測序板時，兩種處理溶劑玻璃硅烷和親和硅烷要戴不同手套處理，嚴謹敷料的交叉污染，避免聚丙烯酰胺凝膠撕裂；測序板上的殘留聚丙烯酰胺不要用刀片刮去， 以免劃傷， 用10% NaOH 浸泡30 min 后除去即可。 ②在凝膠制備過程中，需要溶解的尿素不可加熱溫度過高。 如果確需加熱則應等溶液完全冷卻后，再可加入TEMED 和過硫酸銨；灌制凝膠的過程中要方式微小氣泡的產生，確保聚丙烯酰胺光滑無氣泡，才可以保證測序結果的可靠性。

總之，筆者研究表明，需根據每個物種分別摸索條件，才可以得到穩定、重現性好、特異性強的結果。 本研究建立了蟲草屬聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染的方法，為蟲草屬植物的鑒定及品質評價研究技術平臺的建立奠定了基礎。

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