分光光度計法測定磷脂酶A1酶活條件優(yōu)化

蘇燕南，薛正蓮，馬琦亞，王 洲，趙世光

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽蕪湖 241000)

磷脂酶A1是一類專一性水解卵磷脂sn-1位酰基的酶類，屬于脂肪酶的一種［1］。磷脂酶A1可用于植物油脫膠。相對于傳統(tǒng)的物理和化學脫膠方法，酶法脫膠可以大大降低能耗和污染，且效率高，是一種綠色環(huán)保高效的脫膠方法［2］。目前，用于油脂脫膠的磷脂酶A1為諾維信公司生產(chǎn)的Lecitase Ultra(E.C.3.1.1.3)［3］。磷脂酶 A1 酶活檢測主要是檢測磷脂酶A1水解卵磷脂過程中脂肪酸的生成速度，有滴定法、比色法和氣相色譜法。滴定法是通過滴定消耗的堿量來計算脂肪酸的產(chǎn)量。比色法則是將特定的底物與脂肪酸結(jié)合后，通過測定吸光度值來測量其含量［4］。氣相色譜法則是通過將酶反應生成的脂肪酸甲酯化后測定脂肪酸甲酯的含量［5］。滴定法是現(xiàn)在通用的脂肪酶的測定方法，但是酶反應需要在一定的緩沖體系中進行，而脂肪酸是弱酸，會影響滴定結(jié)果的準確度，而且堿滴定終點的控制要非常精確，否則對于酶活高的樣品會產(chǎn)生較大的誤差。雖然酸堿自動滴定儀也可以避免實驗誤差的產(chǎn)生，但是一次只能測定一個樣品，耗時長。氣相色譜法是相對比較精確的方法，但是樣品處理繁復，耗時長，一般用于定性實驗。采用醋酸銅絡合法可以避免堿滴定過程中緩沖液的影響，并且不存在滴定終點的問題。銅皂-分光光度計法用于脂肪酶酶活的測定已經(jīng)比較成熟［6］。筆者在前期的實驗中比較了滴定法、雙層平板法和分光光度計法3種測定方法，發(fā)現(xiàn)分光光度計測定磷脂酶A1用時短，精確度高，而且底物消耗量小［7］，因此采用分光光度計法測定磷脂酶A1酶活具有很大的優(yōu)勢。但目前還沒有關(guān)于分光光度計法測定磷脂酶A1酶活條件優(yōu)化的相關(guān)報道。本文對影響分光光度計法測定磷脂酶A1酶活過程中的主要因素進行了單因素和正交實驗，并找出測定條件的最佳組合，以期提供一種快速精確檢測磷脂酶A1酶活的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

Lecitase Ultra，購自Novozymes公司;卵磷脂，購自生工生物工程(上海)有限公司;棕櫚酸，購自Sigma公司;其他化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。儀器包括FJ-200高速均質(zhì)機、SK-1快速混勻器、723分光光度計、pH計等。

1.2 主要溶液的配制

1)底物的配制。根據(jù)所需配制的底物濃度，稱取一定量的卵磷脂，溶于相應的緩沖液中，加入終濃度為25 mM的CaCl2和0.02%脫氧膽酸鈉，高速均質(zhì)機10 000 r/min處理15 min。

2)酶溶液的配制。取一定量原酶，用相應緩沖液稀釋至所需倍數(shù)。

3)吡啶-銅鹽顯色劑的配制。5.0%醋酸銅水溶液，用吡啶調(diào)節(jié)pH值至6.1。

4)棕櫚酸異辛烷溶液的配制。精確稱取0.256 4 g棕櫚酸溶于100 mL異辛烷中，配制10 μmol/mL的母液，用此母液分別配制 0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8 μmol/mL 的棕櫚酸異辛烷溶液。

5)終止酶反應溶液配制。6 mol/L HCl:取12 MHCl 50mL加入50 mL蒸餾水即得。0.4M三氯乙酸(TCA):稱取6.54 g TCA溶于100 mL蒸餾水中即得。

1.3 酶活測定

1)棕櫚酸銅皂標準曲線。取5.00 mL棕櫚酸異辛烷加入1.00 mL銅鹽顯色劑溶液，充分混勻90 s，常溫靜置5 min至上層清澈，取3 mL上層清液714 nm測定吸光度值，空白組為相同處理的異辛烷溶液。

2)酶活測定步驟。25 mL具塞試管中加入2.00 mL一定濃度的卵磷脂底物和2.5 mL的緩沖液，40℃預熱5 min，加入0.5 mL酶液，混勻后40℃恒溫振反應15 min，快速加入終止反應溶液終止反應，混勻后加入3 mL異辛烷，充分震蕩混勻90 s，65℃ 靜置分層，常溫冷卻5 min，取上層清液1.00 mL加4 mL異辛烷和1 mL吡啶-銅鹽顯色劑，振蕩混勻90 s，靜置澄清后，取上層有機相714 nm檢測吸光度。空白組為先加入酶反應終止反應液再加入酶液，其他操作相同。在用0.4 M TCA和6 M的HCl終止反應時，將65℃ 靜置分層步驟改為12 000 r/min離心5 min，其他操作相同。

3)磷脂酶A1酶活力單位定義及計算公式。在一定條件下，1 min內(nèi)生成1 μmol棕櫚酸所需的磷脂酶A1的量定義為1個酶活單位。計算公式為

式中:U為磷脂酶A1酶活(U/mL);15為脂肪酸稀釋倍數(shù);C為棕櫚酸濃度(μmol/mL);n為酶液稀釋倍數(shù);t為酶反應時間(min);m為酶用量(mL)。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

脂肪酸會與銅鹽形成銅皂，而且在pH值為6.0～6.2時，銅皂在710±10 nm處吸收峰最強，因此，需要用吡啶調(diào)節(jié)醋酸銅溶液的 pH值為6.1［6，8］。由于磷脂酶 A1水解磷脂的主要脂肪酸產(chǎn)物為棕櫚酸［9］，因此，選用棕櫚酸異辛烷溶液制作標準曲線。如圖1所示，標準曲線方程為y=0.096 5x-0.004 7，相關(guān)系數(shù)為0.999 2，線性關(guān)系良好，可以用于計算溶液中脂肪酸的含量。由圖1可看出，在棕櫚酸濃度增大過程中，數(shù)據(jù)的誤差明顯增大，而且在棕櫚酸濃度超過3.6 μmol/mL時，測得的吸光度數(shù)值偏差很大，且不在線性范圍內(nèi)，因此在測定磷脂酶A1酶活時，酶反應液中的脂肪酸濃度不宜超過3.6 μmol/mL，可以推算該標準曲線適應的酶活范圍為:稀釋后酶活小于等于7.2 U/mL。

圖1 棕櫚酸銅皂標準曲線

2.2 底物濃度對酶活的影響

卵磷脂本身在水中的溶解度較小，常規(guī)方法只能配置5%濃度的乳液［3］，但是在高速均質(zhì)機的作用下，同時加入乳化劑脫氧膽酸鈉，卵磷脂溶液的濃度可以達到10%。分別取2%、4%、6%、8%和10%的卵磷脂作為底物測定稀釋至1 000倍的Lecitase Ultra的磷脂酶A1酶活力，緩沖液pH值為7.0，離子強度為0.05 M，酶失活方式為加入6 mL 95%乙醇。如圖2所示，當?shù)孜餄舛仍?%～6%時，測得的酶活數(shù)據(jù)隨著底物濃度的上升而上升，而當濃度高于6%時，酶活力值的增幅減小，應該是由于底物在此時已經(jīng)達到飽和。綜合考慮節(jié)約材料和酶活較高，后續(xù)單因素實驗的最佳底物濃度選擇8%。

圖2 底物濃度對酶活的影響

2.3 酶液稀釋倍數(shù)對酶活測定的影響

根據(jù)本文2.1節(jié)中的標準曲線預測標準曲線適用范圍為:稀釋后酶活小于等于7.2 U/mL，因此選擇酶液的稀釋倍數(shù)分別為為200倍、500倍、1 000倍、1 500倍和2 000倍，底物濃度為8%，緩沖液pH值為7.0，離子強度為0.05 M，酶失活方式為加入6 mL 95%乙醇。如圖3所示，在稀釋倍數(shù)為1 000倍時，測定的酶活力最高，在稀釋200倍和500倍時，由于酶反應液中的棕櫚酸濃度過高，測得的OD值較高偏差很大，而在稀釋倍數(shù)上升時，尤其在達到2 000倍時，測得的OD值數(shù)值低于0.1，因此誤差也較大。所以最終選擇1 000倍作為最佳稀釋倍數(shù)。

2.4 pH值對酶活的影響

為了考察pH值對酶活的影響，分別配制了一系列pH值的緩沖液，用于稀釋酶液和進行酶反應。pH 值梯度設定為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5和8。底物濃度為8%，酶液稀釋1 000倍，緩沖液離子強度為0.05 M，加入6 mL 95%乙醇終止酶反應。如圖4所示，pH值對酶活的影響比較大。在pH值較低時，酶活明顯受抑制，在pH值為6.0時達到最高值，之后隨著pH值的上升，酶活略有下降。因此，用于稀釋酶液和進行酶反應的pH值設定為6.0。

圖3 稀釋倍數(shù)對酶活測定的影響

圖4 pH值對酶活的影響

2.5 緩沖液離子強度對酶活的影響

由本文2.4節(jié)的實驗結(jié)果可知，Lecitase Ultra磷脂酶A1對酸的耐受力較差，而磷脂酶A1水解卵磷脂會產(chǎn)生脂肪酸，使反應體系的pH值下降，因此反應體系系中的pH緩沖能力不能太弱，而緩沖能力太強勢必會引入大量的離子，也可能會影響酶，因此需要考察緩沖液的離子強度對酶活力的影響。分別配制離子強度為100、50、10和5 mM的pH值為6.0的緩沖液稀釋酶液和用于酶反應，底物濃度為8%，酶稀釋倍數(shù)為1 000倍，終止反應采用加入6mL 95%乙醇的方法。如圖5所示，離子強度為50 mM時酶活力最高，離子強度為100 mM時測得的酶活較低，可見較強的離子強度對酶存在一定的影響，而離子強度較低時酶活也會變低，可能與反應體系的pH值下降有關(guān)。

圖5 離子強度對酶活的影響

2.6 酶失活方式對酶活的影響

實驗過程中還發(fā)現(xiàn)反應終止時酶失活的方式對測得的OD值存在一定影響。在使用乙醇失活時，某些反應液會出現(xiàn)乳濁現(xiàn)象，OD異常，因此嘗試了幾種常用的酶失活的辦法:加入6 mL 95%乙醇、1 mL 6M HCl、1 mL 0.4M TCA 以及 100 ℃ 加熱20 min，分別評估最后的酶活，希望可以得到相對穩(wěn)定的且較高的值。每組設置空白組，為先加失活劑再加入酶液，其他條件相同。在使用HCl和TCA使酶失活時，會產(chǎn)生大量絮狀物，加入異辛烷，65℃靜置需要1～2 h才能分層，因此實驗過程中采用離心的辦法使其快速分層。4組對照組酶活均為0，實驗組結(jié)果如圖6所示。幾種失活方式對比表明，使用乙醇失活的相對誤差較大，HCl其次，使用TCA失活各組測量值偏差較小，酶活稍微高一些，而使用加熱的方式，雖然相對偏差最小，但是酶活出現(xiàn)大幅下降，可能是由于加熱時自由脂肪酸有部分揮發(fā)造成的。因此，使用加入TCA失活的方法相對最佳。

圖6 酶失活方式對酶活的影響

2.7 酶反應條件的正交實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇了對酶活影響較大的幾個因素:pH值、酶液稀釋倍數(shù)和底物濃度進行正交實驗，如表1所示。表2為正交實驗的結(jié)果。實驗結(jié)果表明，對酶活影響最大的因素為底物的濃度，其次為pH值和酶液稀釋倍數(shù)。表3的方差分析結(jié)果顯示:3個因素對酶活的影響都顯著，其中酶液稀釋倍數(shù)的顯著性稍差。預測的最佳酶反應組合為A4B4C2，此時酶活最高值為4 773.8 U/mL。由于在實驗過程中，發(fā)現(xiàn)有其他組合的酶活也較高，因此一起做了驗證實驗，如表4所示。結(jié)果表明:驗證組合為A4B4C2時酶活最高達到4876.9U/mL，即最佳的酶反應條件為:pH值為6.5，酶稀釋倍數(shù)為1 000倍，底物濃度為6%。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果分析

表3 正交實驗方差分析

表4 實驗結(jié)果驗證

3 結(jié)束語

綜合單因素和正交實驗的結(jié)果，優(yōu)化后Lecitase Ultra磷脂酶A1的酶活測定最佳條件為:酶稀釋倍數(shù)為1 250倍，緩沖體系pH值為6.5，離子強度為50 mM，底物濃度為6%，終止酶反應時加入1 mL 0.4M TCA溶液。酶活達到最高值為4 876.9 U/mL，較原工藝得到的酶活(3 978.5 U/mL)提高了18.42%，且平行組得到的數(shù)值穩(wěn)定，相對誤差較小，為今后磷脂酶A1酶活的測定提供了一種高效穩(wěn)定快速的方法。

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