膽固醇、pH值對金屬離子與磷脂酰甘油相互作用成膜的影響

張 橋，劉志存，張靈芝，趙 銳，牛蓉芬，劉春艷

(陜西師范大學物理學與信息技術學院，西安 710062)

目前，制備優質的LB膜正日益受到關注。利用各種方法對LB膜進行相行為與分子組裝的研究對生命過程分析具有重大意義［1］。迄今為止人們對單因素對LB膜的影響的研究已經比較成熟，而研究多因素同時對LB膜的影響還比較少。本文主要研究多因素同時對LB膜的影響。該研究具有廣泛的應用價值，有助于制備更高性能的單分子膜，進而有益于闡明生命過程中能量、物質、信息的傳遞機理［2］。

在LB膜實驗中需要考慮3個或者3個以上的因素對其的影響，因此本研究采用正交實驗。正交實驗不但可以同時安排很多因素進行實驗，而且可以同時尋求最優水平的組合。

1 材料與方法

1.1 儀器分析

LB膜分析儀器是由芬蘭KSV公司生產，型號為Minitrough，分辨率為4 μN/m，膜天平測量范圍為0～150 mN/m，水槽尺寸為364 mm×75 mm×5 mm，滑塊壓縮速度范圍為0.01～400 mm/min，亞相體積為0.16 L，中心深度為70 mm。

1.2 材料

試劑:兩親分子材料——磷脂酰甘油(phosphatidylglycerols，PG)，它有2個非極性的尾部。本實驗材料的兩親分子的極性頭基帶有一個單位的負電荷。膽固醇(cholesterol，Chol)，又稱膽甾醇，是一種環戊烷多氫菲的衍生物。本次實驗所使用PG購于美國Sigma-Aldrich公司，膽固醇購買于上海試劑公司。化學試劑包括無水乙醇、甲醇、氯仿、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl2)，全是國產分析純。水為離子交換二次蒸餾水，pH值為6.8。

1.3 實驗方法

將磷脂酰甘油材料溶于氯仿與甲醇體積比為49∶1的有機溶劑中，膽固醇材料溶于氯仿與甲醇體積比為3∶1混合的有機溶劑中，均制成0.5 mmol/L的溶液。在制備LB膜時，將浴槽溫度控制在24±0.1℃范圍之內。首先將配制好的PG溶液用50 μL微量注射器均勻地滴加在亞相液面之上，其次讓其靜置15 min，目的是為了讓分子自動鋪展，氯仿與甲醇徹底揮發。最后讓LB膜儀器上的2個擋板以10 mm/min速度運動，這時計算機將開始自動記錄π-A曲線數據［3-4］。π-A曲線是指:連續改變不同的條件得到PG單分子所占的單分子面積，此時膜壓π(mN/M)與PG單分子所占面積A的之間的變化關系。表1為pH值、成膜物質的量、亞相及加入膽固醇量的實驗設計數據。

表1 實驗設計數據

2 實驗結果

2.1 Chol對金屬離子磷脂酰甘油單分子的影響

圖1與圖2是亞相分別為金屬離子(KCl、MgCl2)，加入 PG 與 Chol(mol/mol)之比為:1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.7 所掃描的 π -A 曲線。從膽固醇對金屬離子磷脂酰甘油單分子膜的π-A曲線中明顯可以看出:隨著加入膽固醇量的增加，氣相部分明顯減短，崩塌壓壓明顯降低，相變點變化比較凸出，曲線也相對依次外擴，說明膽固醇有加速相變，促進金屬離子磷脂酰甘油單分子膜穩定結構的形成［5］。

圖1 亞相為Kcl溶液，PG與Chol摩爾之比為1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.7 的 π -A 曲線

圖2 亞相為MgCl2溶液，PG與Chol摩爾之比為1∶0、1∶0.3、1∶0.6、1∶0.7 的 π -A 曲線

2.2 pH值對金屬離子單分子膜成膜的影響

圖3和圖4分別是不同pH值所得到的π-A曲線。當亞相是金屬離子，pH值為酸性時，隨pH值不斷升高，相變點依次逐漸變凸。到pH值為6.8時，曲線相變點最為明顯，崩塌壓達到最大值。但是當pH值偏堿性，如在pH值為9.4時，磷脂分子更加緊密，形成較低能量的晶格結構，減小了重組的驅動力，磷脂分子相變有所延遲［6-7］。可見在酸性或者堿性條件下都會對金屬離子PG單分子膜有影響。

圖3 亞相為KCl溶液，pH值為2.6;4.6;6.8;9.4時的π-A曲線

圖4 亞相為MgCl2溶液，pH值為2.6;4.6;6.8;9.4時的π-A曲線

2.3 加入成膜物質的量對金屬離子單分子膜的影響

圖5、6是加不等PG得到的π-A曲線。明顯可以看出:當亞相分別是KCl或MgCl2溶液時，金屬離子與極性頭基之間有靜電相互作用，增強了膜之間的結合能力，使膜分子更加緊密的排列［8-9］。加入 PG 的量在 20、30 μL 時，曲線相對依次外擴，氣相部分隨著PG量的增多而逐漸減少;當加入PG的量為35 μL時，相變點非常凸出，崩塌壓可達到48 mN/m;當向加入 PG的量為45 μL時，曲線的外擴依次增大，但崩塌壓卻降低。以上結果說明成膜物質的量對單分子的形成也是有影響的。

2.4 不同條件下得到分子π-A曲線

以 A(亞相為Water、KCl、MgCl2)，B(加入成膜物質的多少，C(亞相pH值的改變)和D(加入膽固醇的多少)為因素，設計出一個四因素三水平的正交實驗［10］。圖7～9是在不同條件下得到π-A曲線。由于篇幅有限，本文只給出了3幅圖。下面利用正交方法來分析PG單分子膜的最佳成膜條件。

圖5 亞相為KCl溶液，加PG為20、30、35、45 μL 時的 π -A 曲線

圖6 亞相為MgCl2溶液，加PG為20、30、35、45 μL 時的 π -A 曲線

圖7 亞相為MgCl2溶液，加PG為30 μL，Chol為10 μL，pH=9.4時的 π-A 曲線

圖8 亞相為KCl溶液，加PG為35 μL，Chol為0 μL，pH=9.4時的 π -A曲線

圖9 亞相為Water，加 PG 為35 μL，Chol為10 μL，pH=6.8時的 π-A 曲線

2.5 PG單分子面積的正交實驗

表2為正交實驗設計表。

表2 正交實驗設計表

圖10～11是根據其差分析方法繪制的結果。明顯可以看出kA3＞kA1＞kA2，這樣就可斷定A3為A因素的最優水平。同理，可以根據計算并確定B1、C2、D3分別為B、C、D因素的最優水平。由此可以得到4個因素的最優水平組合為:A3B1C2D3。R越大，表示該因素的水平變化對試驗指標的影響越大，因素越重要。由圖12分析可見，RB＞RA＞RC＞RD，因素影響主次順序為B-A-C-D。

圖10 根據極差分析方法繪制的k1、k2、k3值

圖11 根據極差分析方法繪制的R值

3 結束語

綜上所述，膽固醇的量、pH值及成膜物質的多少對形成致密的單分子膜有密切的關系。本文不但分析了單因素對單分子膜的影響，同時也分析了多因素對單分子膜的影響，最后運用正交實驗，得到最佳的PG單分子膜的條件是:亞相為MgCl2，加入成膜物質的量為30 μL，亞相的pH值為6.8，加入膽固醇的量為20 μL。此外，得到了PG單分子成膜質量因素的影響主次順序為:PG量因素高度顯著，亞相物質因素顯著，亞相pH值因素不太顯著，加Chol量因素最不顯著，即B-A-C-D。這對于以后研究生物膜結構和功能有很大的意義及價值。

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