應用分子標記檢測作物雜交種純度研究現狀及比較分析

劉子記，曹振木，楊衍

（中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與種質創制重點開放實驗室，海南儋州，571737）

種子是重要的農業生產資料，是實現農業科技進步的載體。種子質量的優劣直接影響農產品質量和優良品種的增產潛力，而種子質量的好壞在很大程度上取決于種子的純度，開展種子純度檢測對保證種子質量和提高生產效益具有重要意義。生物混雜及機械混雜是影響雜交種純度的主要原因，作物雜交種純度檢驗的常用方法主要包括形態鑒定、田間鑒定和同工酶電泳技術鑒定等[1]。種子形態差異有限，且易受環境條件影響，因此形態鑒定準確性較差；田間鑒定所需時間較長，成本較高，表型易受栽培措施和環境條件的影響，不同的鑒定者對同一性狀的評價也存在一定的差異，不能滿足快速檢測雜交種純度的需要；同工酶鑒定雖然準確、可靠、不受外界環境影響，但多態性不夠豐富，且有組織和器官特異性[2]。

隨著作物新品種數量的不斷增加，遺傳基礎日趨狹窄，傳統的鑒定方法不能有效區分遺傳關系較近的雜交種[3]，難以滿足作物雜交種純度鑒定在精確度方面的要求。近年來，隨著DNA分子標記技術的問世及迅速發展，使得從基因組水平上檢測雜交種純度成為可能。分子標記技術能夠從DNA水平上揭示雜交子代與親本間的遺傳差異，不受植株生長季節的限制，不受基因表達、栽培條件和環境條件的影響，無器官、組織及發育特異性，能夠檢測微小的變異，多態性豐富，穩定性高，可以大大縮短檢驗時間[4]。近年來，分子標記技術在國內外被廣泛應用于作物雜交種純度鑒定。

1 RFLP分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

RFLP （Restriction fragment length polymorphism）分子標記，即限制性片段長度多態性，其基本原理是利用限制性內切酶酶切基因組DNA，酶切后的DNA分子經凝膠電泳、轉膜和變性，利用放射性同位素標記的探針與膜上的DNA片段雜交，檢測由堿基的插入、缺失、重排或點突變引起的多態性，是發展最早的DNA標記技術。

RFLP標記具有穩定可靠、結果準確、不受植物發育階段影響等優點。Smith等[5]利用RFLP分子標記成功鑒定了78個玉米雜交種品種；Matsuura等[6]研究結果表明，利用RFLP標記可快速檢測黃瓜雜交種的純度（表1）。但由于RFLP標記操作程序繁瑣、成本較高、多態性檢出率低、對DNA的需求量大且質量要求較高、并且放射性同位素對操作人員身體有害，此法不適于進行大批量雜交種純度鑒定，在實際應用中受到限制。

2 RAPD分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

RAPD（Random amplified polymorphic DNA）標記，即隨機擴增多態性DNA，該技術建立在PCR基礎上，以基因組DNA為模板，以10個堿基左右的隨機寡聚核苷酸序列為引物，檢測遺傳位點的多態性，可對未知序列的基因組進行多態性分析。該技術具有操作簡便、成本低、自動化程度高、分辨率高、實驗周期短、靈敏度強、檢測位點多、DNA用量少等優點，能有效檢測從形態和生化指標上均無法檢測到的差異，被廣泛用于雜交種純度鑒定、基因定位和基因克隆等多方面研究。RAPD標記被成功應用于苦瓜[7]、冬瓜[8]、南瓜[9]和西瓜[10]等瓜類作物雜交種純度的鑒定；莫結勝等[11]利用RAPD標記鑒定雜交油葵種子純度，鑒定結果與大田檢測結果基本一致；朱海山等[12]和葛菊芬等[13]研究結果表明，RAPD標記可以用于番茄和辣椒等茄果類作物雜交種純度的鑒定；邵景俠等[14]成功利用RAPD標記對雜交小麥西雜一號進行純度鑒定（表1）。

由于RAPD標記屬于顯性標記，不能有效區分純合基因型和雜合基因型，另外其穩定性和重復性較差，易受各種因素的影響，通常將其轉化為SCAR（Sequenced characterized amplified regions）標記，其原理是將多態性片段回收、克隆、測序后，設計出較長的引物進行特異擴增，可以顯著提高檢測的穩定性和實用性。陳靈芝等[15]成功將RAPD標記轉化成SCAR標記，有效地將隴椒5號辣椒雜交種與母本區分開來；王飛等[16]建立了檢測金棚1號番茄雜交種純度的SCAR標記技術體系，為金棚1號番茄種子的生產與銷售提供了有效的檢測方法（表1）。

3 AFLP分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

AFLP（Amplified fragment length polymorphism）分子標記，即擴增片段長度多態性，該技術利用限制性內切酶酶切基因組DNA，將特定的接頭與酶切后的DNA片段連接，根據接頭與酶切位點的序列設計PCR引物進行擴增，檢測遺傳位點多態性。

該技術具有多態性豐富、重復性高、可靠性好、不需要預先知道基因組序列信息等優點。劉杰等[17]試驗結果證明，利用AFLP標記檢測向日葵雜交種純度是可行的；宋順華等[18]成功利用AFLP技術將90個大白菜品種區分開來；王玲平等[19]以瓠瓜雜交種浙蒲2號及其父、母本為材料，成功建立了利用AFLP分子標記進行瓠瓜雜交種純度鑒定的技術體系（表1）。但由于操作繁瑣、對試驗技能要求較高，試驗周期較長，對DNA的質量要求很高，AFLP技術難以在種子純度鑒定中獲得廣泛應用。

4 SSR分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

SSR（Simple sequence repeats）標記，即簡單序列重復，是一類由幾個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列，SSR兩側的序列一般相對保守，通過設計特異引物進行擴增，根據串聯重復單位數目的差異檢測多態性。

SSR標記具有數量豐富、在染色體上分布均勻、多態性高、共顯性遺傳、等位性變異豐富、重復性好、對DNA質量要求不高且需要量少、操作簡單、不受環境因素影響等優點，已在多種農作物雜交種純度鑒定中得到應用。蘭剛等[2]、王愛娜等[20]和宋賢勇等[21]分別利用SSR標記對油菜雜交種合油雜2號、秦優33和秦優11進行純度鑒定，鑒定結果與田間鑒定結果基本一致；高海娜等[22]和苗明軍等[23]成功利用SSR標記對甘藍雜交種秦甘50和西園4號進行純度鑒定；管志坤等[24]利用SSR標記鑒定油綠3號大白菜品種純度，鑒定結果與田間鑒定結果非常接近；SSR 標記廣泛用于西瓜[25]、黃瓜[26，27]、瓠瓜[28]、甜瓜[29，30]雜交種純度鑒定，初步建立了利用SSR分子標記鑒定瓜類作物雜交種純度的技術體系；大量研究表明，SSR標記可應用于玉米雜交種鄭單 958[31]、黔單 16[32]、寧單 11[33]純度鑒定，與田間鑒定相比，準確性更高，速度更快，能大大提高檢測效率；王利英等[34]和白占兵等[35]研究結果表明，利用SSR分子標記檢測茄科作物茄子和辣椒雜交種純度可行且高效，具有一定的理論和應用價值；陳志偉等[36]研究結果證明，利用SSR分子標記可以快速、有效地鑒定大麥雜交種純度；田蕾等[37]利用多對SSR標記鑒定大豆雜交種純度，檢測結果完全一致；趙振卿等[38]利用SSR標記對花椰菜雜交種浙801純度進行鑒定，鑒定結果與田間鑒定結果一致（表1）。

開發基因組SSR標記成本較高、步驟繁瑣、費時費力。EST-SSR （expressed sequence tag-simple sequence repeat）標記是根據EST序列中的簡單串聯重復序列開發的一種標記類型，具有SSR標記和EST技術的優點，并且降低了開發成本、節省了開發時間、提高了開發效率，另外，EST序列高度的保守性使得EST-SSR標記在種與品種間有較好的通

用性，顯著提高了其利用價值。近年來，隨著基因組測序的發展，豐富的EST序列資源為EST-SSR標記的開發提供了有利途徑。盧銳等[39]篩選出2對EST-SSR標記，可用于黃瓜雜交種純度的鑒定；張庶等[40]研究結果表明，EST-SSR標記可以快速、準確地鑒別大白菜雜交種純度；張國裕等[41]利用ESTSSR標記對南瓜屬作物雜交種進行純度檢測，與田間鑒定結果相符；匡猛等[42]試驗結果證明，利用EST-SSR標記鑒定棉花雜交種純度與田間鑒定結果的相關性顯著高于基因組SSR標記；趙新等[43]篩選得到1對共顯性的EST-SSR標記，可用于花椰菜雜交種純度的鑒定，鑒定結果與田間形態鑒定結果較為一致。

表1 分子標記技術在作物雜交種純度鑒定中的應用

5 SRAP分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

SRAP （Sequence-related amplified polymorphism）標記，即相關序列擴增多態性，該技術通過獨特的引物設計對基因的開放閱讀框區域進行擴增，上游引物與外顯子區域特異結合，下游引物與啟動子或內含子區域結合，檢測不同個體間內含子、啟動子及間隔區序列長度不同產生的多態性。

該標記技術具有操作簡單、高共顯性、穩定性強、分辨率較高、重復性好、成本低、在基因組中分布均勻等特點，在作物雜交種純度鑒定中有著廣泛的應用。扈新民等[44]利用SRAP分子標記對辣椒雜交種航椒4號進行純度檢測，與田間鑒定結果十分接近。鐘開勤等[45]研究結果證明，SRAP標記可以用于花椰菜雜交種純度鑒定；張永平等[46]和熊麗曼等[47]成功利用SRAP標記對甜瓜雜交種進行純度檢測；黃建都等[48]研究結果表明，SRAP標記技術可用于甘藍雜交種夏華2號純度鑒定，鑒定結果與田間鑒定結果一致；蓋樹鵬等[49]試驗結果證明，與SSR標記相比，利用SRAP標記檢測雜交種純度更接近田間鑒定結果（表1）。

6 SNP和InDel分子標記在鑒定作物雜交種純度中的應用

隨著作物基因組測序工作的進展，新型分子標記 InDel （Insertion-deletion） 和 SNP （Single nucleotide polymorphism）的開發越來越容易，為利用新型分子標記進行作物雜交種純度鑒定創造了有利條件。InDel標記，即插入缺失標記，指由核苷酸水平上堿基的插入或缺失引起的多態性。SNP標記，即單核苷酸多態性，指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。

InDel和SNP標記具有數量豐富、穩定性好、高通量和高度自動化等優點。蘭青闊等[50]利用InDel標記檢測黃瓜津優38雜交種純度，與SSR標記鑒定結果基本一致；張體付等[1]成功利用InDel標記對6個玉米雜交種進行了純度鑒定；蘭青闊等[51]基于SNP標記檢測黃瓜雜交種優一種子純度，鑒定結果與SSR標記鑒定結果相符。

7 展望

隨著生物技術的不斷發展，作物雜交種純度鑒定技術也由主要依賴田間鑒定進入分子鑒定水平，分子標記技術因其快速、準確、穩定、節省大量人力和財力以及不受環境因素影響等特點，逐步成為作物雜交種純度檢測的首選工具，為雜交種純度鑒定提供了一種更為有效和可靠的方法[52]。不同的分子標記技術具有不同的優缺點，在實際應用中，要根據研究對象充分發揮標記技術優勢，這樣才能更準確、快速地達到鑒定目的。

在作物雜交種制種過程中，由于隔離不嚴導致的生物混雜是不可避免的現象，因此，利用單對標記鑒定雜交種純度具有一定的局限性。為確保鑒定結果的準確性和可靠性，應同時對供試樣品的多個遺傳位點進行檢測分析。選取位于染色體不同區域的標記組合起來進行檢測，不僅可以區分親本自交種，還能有效檢測出其他來源花粉所導致的生物性混雜。

分子生物學技術的飛速發展將會導致新的分子標記不斷出現，現有的技術也會不斷得到完善。將分子標記技術與傳統育種方法相結合，可快速、準確地對雜交種純度進行早期檢測，對于保證種子質量和優良品種推廣具有重要意義。

[1]張體付，葛敏，韋玉才，等.玉米功能性 Insertion/Deletion(InDel)分子標記的挖掘及其在雜交種純度鑒定中的應用[J].玉米科學，2012，20（2）：64-68.

[2]蘭剛，董軍剛，孟倩，等.油菜雜交種合油雜2號純度鑒定的 SSR 引物篩選[J].西北農業學報，2012，21（9）：74-78.

[3]Salgado K C PC,Vieira G G C,Von Pinho E V R.Genetic purity certificate in seeds of hybrid maize using molecular markers[J].Revista Brasileira de Sementes,2006,28(1):169-175.

[4]譚美蓮，嚴明芳，汪磊，等.蓖麻雜交種的SSR鑒定及遺傳變異分析[J].西北植物學報，2012，32（8）：1 539-1 546.

[5]Smith O S,Smith JSC,Bowen S L,et al.Similarities among a group of elite maize inbreds asmeasured by pedigree,F1grain yield,grain yield,heterosis,and RFLPs[J].Theor Appl Genet,1990,80(6):833-840.

[6]Matsuura S,Saito A,Fujita Y.An approach for rapid checking of seed purity by RFLP analysis of nuclear DNA in F1hybrid of cucumber(Cucumis sativus L.)[J].Journal of the Japanese Society for Horticultural Science,1994,63(2):379-383.

[7]林琿，李永平，朱海生，等.應用RAPD標記鑒定苦瓜雜種純度[J].福建農業學報，2011，26（6）：977-980.

[8]盧文佳，李智軍，李春艷，等.黑皮冬瓜黑老粗F1種子純度的 RAPD 鑒定[J].中國蔬菜，2010（12）：46-49.

[9]羅伏青，孫小武，董亞靜，等.RAPD標記鑒定南瓜種子純度的研究[J].華北農學報，2008，23（3）：63-66.

[10]閆鵬，張建農，陳雨.西瓜和甜瓜雜種一代種子純度的RAPD 鑒定[J].甘肅農業大學學報，2007，42（2）：43-46.

[11]莫結勝，劉杰，劉公社.雜交油葵A15種子純度的RAPD鑒定[J].作物學報，2001，27（1）：85-90.

[12]朱海山，張宏，毛昆明，等.RAPD標記鑒定番茄雜交種子純度的研究[J].云南農業大學學報，2003，18（3）：270-272.

[13]葛菊芬，張魯剛，程智慧，等.利用RAPD技術快速鑒定辣椒雜交種純度的研究[J].辣椒雜志，2010（4）：29-32.

[14]邵景俠，張改生，趙偉，等.雜交小麥‘西雜一號’種子純度鑒定的研究[J].西北植物學報，2007，27（6）：1 108-1 111.

[15]陳靈芝，張建農，王蘭蘭，等.利用SCAR標記鑒定‘隴椒5號’辣椒種子的純度[J].甘肅農業大學學報，2011，46（1）：55-57.

[16]王飛，姚明華，鞏振輝，等.金棚1號番茄種子純度檢測的 SCAR 標記[J].中國蔬菜，2009（2）：26-29.

[17]劉杰，劉公社，齊冬梅，等.向日葵品種鑒定和純度分析的 AFLP 研究[J].植物學通報，2002，19（4）：444-451.

[18]宋順華，鄭曉鷹.AFLP分子標記鑒別大白菜品種[J].分子植物育種，2005，3（3）：381-387.

[19]王玲平，戴丹麗，吳曉花，等.AFLP分子標記技術在浙蒲2號種子純度快速鑒定中的應用[J].浙江農業學報，2008，20（2）：84-87.

[20]王愛娜，王灝，趙亞軍，等.甘藍型化學殺雄雜交油菜品種秦優33種子純度的SSR鑒定[J].農業生物技術學報，2011，19（6）：1 011-1 018.

[21]宋賢勇，包月紅，楊俊濤，等.利用SSR標記鑒定甘藍型油菜秦優 11 號種子純度[J].分子植物育種，2010，8（3）：497-500.

[22]高海娜，張恩慧，李殿榮，等.甘藍一代雜種純度SSR鑒定與田間鑒定的一致性研究[J].西北農林科技大學學報，2012，40（5）：117-122.

[23]苗明軍，李成瓊，司軍，等.結球甘藍西園4號種子純度的 SSR 鑒定[J].中國蔬菜，2011（2）：53-55.

[24]管志坤，羅雙霞，李艷霞，等.利用SSR標記鑒定油綠3號大白菜品種純度[J].種子，2011，30（9）：34-39.

[25]艾成祥，余賢美，劉慶忠，等.利用SSR標記鑒定西瓜雜交種純度的研究[J].西北植物學報，2006，26（10）：2 006-2 010.

[26]楊瑞環，崔興華，李鵬宇，等.SSR技術檢測‘津優48’種子純度試驗[J].北方園藝，2012（16）：108-109.

[27]張桂華，李家旺，張文珠，等.利用SSR技術對黃瓜新品種津優35號進行種子純度鑒定[J].北方園藝，2010（10）：184-185.

[28]魯忠富，徐沛，吳曉花，等.SSR分子標記技術在瓠瓜種子純度快速鑒定中的應用[J].浙江農業學報，2012，24（4）：578-581.

[29]艾呈祥，陸璐，馬國斌，等.SSR標記技術在甜瓜雜交種純度檢驗中的應用[J].園藝學報，2005，32（5）：902-904.

[30]李菊芬，許玲，馬國斌.應用SSR分子標記鑒定甜瓜雜交種純度[J].農業生物技術學報，2008，16（3）：494-500.

[31]李藝，鐵雙貴，朱位紅，等.鑒定玉米雜交種鄭單958種子純度的 SSR 標記篩選[J].玉米科學，2008，16（1）：40-43.

[32]郭向陽，陳澤輝，祝云芳，等.利用SSR標記鑒定玉米雜交種黔單 16 號純度的研究[J].種子，2011，30（4）：42-44.

[33]李苗，李新，甘曉燕，等.SSR標記對寧單11種子純度的鑒定[J].種子，2010，29（9）：38-43.

[34]王利英，喬軍，石瑤，等.茄子SSR多態性引物的篩選及品種純度鑒定[J].華北農學報，2012，27（4）：98-101.

[35]白占兵，李雪峰，戴雄澤.利用SSR分子標記建立辣椒純度鑒定體系[J].辣椒雜志，2010（1）：32-34.

[36]陳志偉，李梁，陸瑞菊，等.一種利用SSR分子標記對大麥雜交種快速鑒定的方法[J].浙江農業學報，2010，22（6）：736-740.

[37]田蕾，關榮霞，劉章雄，等.用SSR標記鑒定大豆雜交組合 F1的方法研究[J].植物遺傳資源學報，2008，9（4）：443-447.

[38]趙振卿，盛小光，虞慧芳，等.花椰菜新品種浙801雜交種純度的 SSR 鑒定[J].長江蔬菜，2011（18）：18-20.

[39]盧銳，葉永亮，馮國軍.EST-SSR標記在黃瓜F1種子純度鑒定中的應用[J].北方園藝，2010（18）：136-138.

[40]張庶，周新成，李利斌，等.利用EST-SSR標記鑒定大白菜雜交種純度的研究[J].天津農業科學，2010，16（6）：1-4.

[41]張國裕，張帆，姜立綱，等.南瓜屬EST-SSR標記的開發及在雜種純度鑒定中的應用[J].華北農學報，2011，26（6）：97-101.

[42]匡猛，楊偉華，張玉翠，等.棉花雜交種純度的SSR標記檢測及其與田間表型鑒定的相關性[J].作物學報，2011，37（12）：2 299-2 305.

[43]趙新，文正華，王永，等.花椰菜雜交種科潤F1代種子純度的 EST-SSR 鑒定[J].種子，2012，31（5）：119-122.

[44]扈新民，李亞利，趙丹，等.辣椒SRAP分子標記的優化及在航椒4號種子純度檢測中的應用[J].長江蔬菜，2010（22）：7-11.

[45]鐘開勤，朱朝輝，陳文輝，等.利用SRAP標記鑒定“松花55天”花椰菜一代雜種的純度[J].分子植物育種，2011，9（6）：749-753.

[46]張永平，楊少軍，陳幼源.SRAP標記技術在甜瓜品種親緣關系和種子純度鑒定上的應用[J].生物學雜志，2012，29（4）：86-95.

[47]熊麗曼，王賢磊，高興旺，等.應用SRAP標記鑒定甜瓜種子純度[J].種子，2012，31（2）：9-12.

[48]黃建都，邵貴榮，陳文輝，等.SRAP標記在夏華2號甘藍種子純度檢測中的應用[J].中國瓜菜，2012，25（2）：15-17.

[49]蓋樹鵬，蓋偉玲，黃進勇.SSR與SRAP標記在玉米品種鑒定中的比較研究[J].植物遺傳資源學報，2011，12（3）：468-472.

[50]蘭青闊，張桂華，王永，等.基于InDel標記快速檢測黃瓜津優 38 種子純度[J].種子，2011，30（6）：19-23.

[51]蘭青闊，張桂華，王永，等.基于SNP標記的黃瓜雜交種純度鑒定方法[J].中國蔬菜，2012（6）：58-63.

[52]Yashitola J,Thirumurugan T,Sundaram R M,et al.Assessment of purity of rice hybrids using micro satellite and STS markers[J].Crop Science,2002,42(4):1 369-1 373.