應(yīng)用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法快速鑒別人參和西洋參須根

陳邦元，徐金娣，丁 妍，朱玲英，李松林

西洋參為五加科植物西洋參(Panax quinquefolium L)的干燥根，能補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津［1］。人參為五加科植物人參(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根，能滋補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智、調(diào)榮養(yǎng)衛(wèi)、大補(bǔ)元?dú)狻?fù)脈固脫，是常用的滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥［2］。西洋參和人參在中國(guó)均有栽培，其須根是西洋參和人參生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)品，因皂苷含量高，且價(jià)格分別比西洋參和人參低廉，近年來(lái)被用來(lái)作為開(kāi)發(fā)保健產(chǎn)品的原料或直接應(yīng)用。但西洋參須根和人參須根在形態(tài)學(xué)上無(wú)明顯區(qū)別，文獻(xiàn)亦沒(méi)有鑒別方法的報(bào)道，因此迫切需要一種快速方法對(duì)其予以準(zhǔn)確鑒定。

1 材料與方法

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 Waters UPLC H-Claaa/TQD 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司);梅特勒十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q純水器(美國(guó)Milli-Q公司)。

1.1.2 試劑和藥材 西洋參須根(JSPACM-03-64-1)，2012年 10月采自山東文登;人參須根(JSPACM-03-63-1)，2011年10月采自吉林通化，標(biāo)本存江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥分析和代謝組研究室。人參皂苷Rf(Ginsenoside Rf)和24(R)-擬人參皂苷F11(24(R)-pseudoginsenoside F11)分別從人參和西洋參中分離純化制得，結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和MS分析確證，純度經(jīng)高效液相分析大于95%，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。乙腈(色譜純，美國(guó)，Tedia公司)、甲酸(色譜純，日本，東京化成工業(yè)株式會(huì)社)、甲醇(分析純，南京，漢邦科技公司)。

圖1 人參皂苷Rf和24(R)-擬人參皂苷F11結(jié)構(gòu)式

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)色譜柱;采用乙腈(B)-0.1%甲酸水溶液(A)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度如下:0～1 min，5% ～15%B;1 ～10 min，15% ～35%B;10～14 min，35% ～42%B;14～24 min，42% ～80%B;24～25 min，80% ～5%B;25 ～27 min，5%B;柱溫40°C;流速 0.5 ml/min;進(jìn)樣量 4 μl。

1.2.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓為2.5 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔氣流量50 L/h，掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)300～2000。子離子掃描，母離子799，碰撞能量30 V，錐孔電壓30 V。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取人參皂苷Rf(A)和24(R)-擬人參皂苷F11(B)適量，用甲醇配制成濃度為10 μg/ml的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液(Std)A和B，于4℃存放備用。

1.2.4 供試品溶液的制備 將人參須根和西洋參須根粉碎成細(xì)粉，精密稱取兩種粉末各5.0 g分置具塞錐形瓶中，加入50 ml 70%甲醇溶液超聲(500 W，40 kHz)處理45 min取出，以半徑8 cm、10 000 rpm，離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，得濾液，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的超高效液相分離和質(zhì)譜檢測(cè)人參皂苷Rf(tR 7.77 min)和24(R)-擬人參皂苷F11(tR 7.92 min)能達(dá)到基線分離，總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 人參皂苷Rf(tR 7.77 min)和24(R)-擬人參皂苷F11(tR 7.92 min)總離子色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的質(zhì)譜全掃描及子離子掃描 分別對(duì)人參皂苷Rf和24(R)-擬人參皂苷F11進(jìn)行質(zhì)譜全掃描并對(duì)分子離子峰進(jìn)行子離子掃描(全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3，二級(jí)裂解圖見(jiàn)圖4)。由圖3可見(jiàn)，二者均有m/z 799［M-H］－的分子離子峰和m/z 845［MH+HCOOH］－加合離子峰，但人參皂苷Rf的分子離子峰強(qiáng)度大于加合離子峰(A)，而24(R)-擬人參皂苷F11的分子離子峰強(qiáng)度要比加合離子峰弱(B)。由圖4可見(jiàn)，二者均有m/z 799［M-H］－的分子離子峰，但人參皂苷 Rf具有 m/z 475［M-H-2(Glu-H2O)］－碎片離子峰(圖4A)，24(R)-擬人參皂苷F11具有m/z 653［M-H-(Rha-H2O)］-碎片離子(圖4B)。

圖3A 人參皂苷Rf質(zhì)譜全掃描圖

圖3B 24(R)-擬人參皂苷F11質(zhì)譜全掃描圖

圖4A 人參皂苷Rf子離子掃描圖

圖4B 24(R)-擬人參皂苷F11子離子掃描圖

2.3 樣品鑒定分析 在同樣條件下分別對(duì)人參須根樣品和西洋參須根樣品進(jìn)行分析，總離子流圖、全掃描質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5和圖6。在人參須根樣品中有tR 7.78的峰出現(xiàn)(圖5A)并且具有m/z 799［MH］－的分子離子峰和m/z 845［M-H+HCOOH］－加合離子峰(圖5B)，且前者強(qiáng)度比后者強(qiáng)，子離子掃描中，檢測(cè)到m/z 475［M-H-2(Glu-H2O)］－(圖5C);在西洋參須根樣品中有tR 7.90的峰出現(xiàn)(圖6A)，且具有m/z 799［M-H］－的分子離子峰和 m/z 845［M-H+HCOOH］－加合離子峰(圖6B)，前者強(qiáng)度比后者弱，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了24(R)-擬人參皂苷F11的碎片離子峰653［M-H-(Rha-H2O)］－(圖6C)。

圖5A 人參須根樣品總離子流圖

圖5B 人參須根樣品峰tR7.78min全掃描質(zhì)譜圖

圖5C 人參須根樣品峰tR7.78min子離子掃描質(zhì)譜圖

圖6A 西洋參須根樣品總離子流圖

圖6B 西洋參須根樣品峰全掃描質(zhì)譜圖

圖6C 西洋參須根樣品峰子離子掃描質(zhì)譜圖

3 討論

傳統(tǒng)的藥材鑒別方法有形態(tài)學(xué)鑒別、顯微鑒定等，現(xiàn)代手段有 DNA 條形碼技術(shù)［3-4］、色譜［5］和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用手段［6-8］等。由于藥材發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含有的化學(xué)成分，因此，從保證藥材的有效性和安全性角度看，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒別是更能體現(xiàn)藥材有效性和安全性的方法。

人參中主要成分是人參皂苷，分為人參二醇型人參皂苷和人參三醇型人參皂苷［9］;而西洋參中也主要含人參皂苷，其中人參皂苷 Rb1、Re、Rd、Rc、Rg1和Rb3是其六個(gè)主要皂苷，占總皂苷的70%左右［10］。雖然二者主要成分大部分類似，但有學(xué)者［11-12］對(duì)人參和西洋參進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rf只在人參中存在，而24(R)-擬人參皂苷F11只存在于西洋參中，因此這兩種皂苷可作為特征性成分區(qū)分西洋參和人參。也有學(xué)者［13］研究發(fā)現(xiàn)Rg1/Rb1與Rb2/Rb1的比值在西洋參中小于0.4，而在人參中大于0.4。但 Schlag等［14］指出在野生西洋參中，Rg1/Rb1值較高，大于0.4。可見(jiàn)這種鑒別方法存在一定局限性。人參和西洋參可以通過(guò)特征成分的存在進(jìn)行區(qū)別，但人參須根和西洋參須根中是否也同樣分別含有這兩種特征性皂苷成分，能否通過(guò)這兩種特征成分區(qū)分人參須根和西洋參須根則未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)對(duì)人參皂苷Rf和24(R)-擬人參皂苷F11的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雖然二者均可見(jiàn)m/z 799［M-H］－的分子離子峰和m/z 845［M-H+HCOOH］－加合離子峰，但二者的這兩種離子的離子強(qiáng)度和分子離子峰的二級(jí)裂解行為存在差異。對(duì)于人參皂苷Rf，其分子離子峰強(qiáng)度要比加合離子峰強(qiáng)，并且在其二級(jí)質(zhì)譜中可見(jiàn)m/z 475［MH-2(Glu-H2O)］－的特征碎片離子，而對(duì)于24(R)-擬人參皂苷F11，其分子離子峰強(qiáng)度要比加合離子峰弱，并且其二級(jí)質(zhì)譜中可見(jiàn)m/z 653［M-H-(Rha-H2O)］－的特征碎片離子。本研究中，在同樣條件下，利用所建立的分子離子峰與加合離子峰強(qiáng)度差異和特征碎片離子鑒別法對(duì)人參須根和西洋參須根進(jìn)行色譜-質(zhì)譜分析，人參須根樣品中出現(xiàn)了人參皂苷Rf的質(zhì)譜特征，而未見(jiàn)24(R)-擬人參皂苷F11的質(zhì)譜特征;在西洋參樣品中出現(xiàn)了24(R)-擬人參皂苷F11的質(zhì)譜特征，而未見(jiàn)人參皂苷Rf的質(zhì)譜特征。

綜上所述，本研究所建立的以24(R)-擬人參皂苷F11和人參皂苷F11為特征成分的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有快速和高選擇性特點(diǎn)，是快速鑒別商品西洋參須根和人參須根的有效分析方法。

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