火炮打擊兔應(yīng)激防護模型腸組織病理及NMDAr1表達的形態(tài)學(xué)研究

劉勝利 張建華 俞雄杰 周 龍 林進皇 余 海 郁毅剛▲

1.解放軍第一七五醫(yī)院暨廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院神經(jīng)外科，福建漳州 363000；2.解放軍73131部隊，福建漳州 363000

在現(xiàn)代戰(zhàn)爭中，火炮打擊帶來的爆震性損傷，仍是部隊減員最為重要的原因之一。而火炮打擊后，除可見的肢體損傷外，由此引起的應(yīng)激炎癥反應(yīng)綜合征，對有生力量戰(zhàn)斗力的影響不可忽視。本實驗探討了在模擬實戰(zhàn)情況下火炮打擊后，爆震傷引起的兔的應(yīng)激炎癥反應(yīng)綜合征的情況，在之前筆者分別探討了卵巢、血清自由基等組織器官對于應(yīng)激反應(yīng)的病理及免疫組織化學(xué)的形態(tài)學(xué)變化[1-2]。本實驗主要探討腸組織病理改變及免疫組織化學(xué)中的NMDAr1（N-methyl-D-asparate receptor-1，NMDAr1）受體在腸應(yīng)激反應(yīng)中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及動物

團進攻炮火覆蓋火力類型：武裝直升機火箭彈、XX自行榴彈炮、XX牽引加農(nóng)炮、XX自行火箭炮、水陸兩棲坦克、XX輪式突擊炮、XX迫擊炮、XX反坦克導(dǎo)彈。健康成年日本大耳白兔30只，雌雄不拘，清潔級，體質(zhì)量2.5～3.0 kg（廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供）；按照隨機表法分為3組，空白對照組6只、反角隱蔽組6只、迎面隱蔽組18只（距離攻擊目標(biāo)10 m隱蔽組6只，20 m隱蔽組6只，30 m組隱蔽6只）。

1.2 實驗方法

按照文獻方法設(shè)計實驗[1]，實驗時間和環(huán)境條件為南方秋季中午山地環(huán)境，環(huán)境溫度16～28℃，濕度為43%～65%。實驗兔常規(guī)喂養(yǎng)，演習(xí)當(dāng)日凌晨運至目標(biāo)高地，炮靶前迎面10、20、30 m處挖掘約1 m深掩體，各放置實驗兔6只，上覆蓋硬質(zhì)木板、松枝，留通氣道。炮靶后反角10 m處挖掘同樣掩體，放置實驗兔6只。空白對照組于炮靶陣地外10 km營區(qū)喂養(yǎng)。中午演習(xí)開始，全過程2 h。轟炸機俯沖（未投彈），持續(xù)火炮急襲5 min。各型火炮、坦克、導(dǎo)彈、武裝直升機集群連續(xù)發(fā)彈若干，期間暫停2次，各10 min。演習(xí)結(jié)束，工兵排爆清理陣地后進場取回實驗兔。傷后6 h處死存活兔解剖，取腸組織標(biāo)本，4%甲醛固定。

1.3 腸組織病理檢測

取4%甲醛固定腸組織，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化，由同一病理醫(yī)師采用盲法評價。觀察腸組織結(jié)構(gòu)層次是否完整，腸組織細(xì)胞腫脹、變性、壞死，間質(zhì)出血、水腫等情況。

1.4 腸組織NMDAr1免疫組織化學(xué)表達的測定

取4%甲醛固定腸組織，石蠟包埋，連續(xù)切片（4μm），每例標(biāo)本切5張免疫組織化學(xué)染色用。采用改進型SP法進行免疫組織化學(xué)染色，嚴(yán)格參照試劑盒說明操作。試劑盒型號，購于XX公司。每次染色時均用已知陽性切片作陽性對照，用PBS（磷酸緩沖液，0.01 mol/L，pH 值 7.2）代替一抗作陰性對照。NMDAr1表達均位于胞質(zhì)和胞核內(nèi)，表現(xiàn)為淺黃、棕黃或棕褐色。用半定量法評估其染色，無陽性細(xì)胞數(shù)為（-），陽性細(xì)胞數(shù)＜25%為（+），25%～50%為（++），51%～75%為（+++），＞75%為（++++）。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗兔的一般情況

各組實驗兔均無直接火力命中。與空白對照組比較，反角隱蔽組實驗兔全部存活，部分精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、伏地，少部分耳道出血。因彈著點不規(guī)律，迎面隱蔽3組距離無差異，合并為一組。迎面隱蔽組18只實驗兔當(dāng)場死亡9只，至傷后6 h取腸組織標(biāo)本前再死亡3只，死亡率達66.7%（12/18）。剩余6只存活實驗兔編為迎面隱蔽組，與另外兩組同時刻點取腸組織進行病理形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測，每只取5張切片進行免疫組織化學(xué)表達強度及形態(tài)學(xué)觀察研究。

2.2 腸組織HE染色結(jié)果

空白對照組腸組織切片HE染色顯示，腸黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層完整，結(jié)構(gòu)均勻致密。環(huán)形皺壁表面存在多量不規(guī)則形狀柱狀絨毛，其間上皮及固有層完整。上皮間混雜杯狀細(xì)胞。絨毛中心為結(jié)締組織，可見黏膜下神經(jīng)叢。絨毛基底可見潘氏細(xì)胞和肌間神經(jīng)叢分布，肌漿深染，膠質(zhì)豐富，可見散在分布血管，腔內(nèi)少量紅細(xì)胞，未見明顯炎癥細(xì)胞（圖1、圖2）。反角隱蔽組腸組織切片HE染色顯示，分層結(jié)構(gòu)存在。柱狀絨毛上皮頂部變性壞死，局部脫落，上皮細(xì)胞胞質(zhì)空泡變性；細(xì)胞間少量紅細(xì)胞，炎癥細(xì)胞浸潤（圖3、圖4）。迎面隱蔽組腸組織切片HE染色顯示，細(xì)胞結(jié)構(gòu)層紊亂，分界不清，部分壞死，崩解；細(xì)胞數(shù)明顯減少，黏膜層及下層和肌層分離；可見散在紅細(xì)胞分布，漿細(xì)胞浸潤（圖 5、圖 6）。

2.3 腸組織NMDAr1免疫組織化學(xué)的表達

空白對照組見柱狀絨毛完整，絨毛中心固有層可見分布NMDAr1表達陽性神經(jīng)叢棕染，NMDAr1蛋白少量表達（+）（圖7、圖 8）；反角隱蔽組可見絨毛腫脹，固有層變性，細(xì)胞減少，黏膜上皮細(xì)胞中神經(jīng)叢廣泛棕染（++），NMDAr1中量表達（圖9、圖10）；迎面隱蔽組，可見絨毛壞死崩解，全部胞質(zhì)、胞膜均棕染，色深。NMDAr1大量表達（++++）（圖11、圖12）。迎面隱蔽組、反角隱蔽組NMDAr1免疫反應(yīng)強度均高于對照組，迎面隱蔽組NMDAr1免疫反應(yīng)強度亦高于反角隱蔽組。

2.4 NMDAr1表達與組織病理的關(guān)系

通過3個實驗組的觀察，空白對照組、反角隱蔽組與迎面隱蔽組NMDAr1免疫組織化學(xué)的表達量逐漸遞增，腸的病理改變也由可逆的變性加重為不可逆的壞死（表1）。

表1 NMDAr1表達與組織病理的關(guān)系

3 討論

在火炮打擊后，對比空白對照組、反角隱蔽組及迎面隱蔽組3組的生存率，發(fā)現(xiàn)反角掩體兔的存活率為100.0%（18/18），而迎面隱蔽組死亡率高達 66.7%（12/18），其有力地說明戰(zhàn)地反角隱蔽可有效保證在密集火炮打擊下生存。同時，也可說明迎面角投彈可有效消滅敵軍。此外，如何減輕有生力量對炮擊帶來的爆震、彈片、噪聲、應(yīng)激、精神損傷等復(fù)合性損傷，保障有生力量的戰(zhàn)斗力也極為重要。目前研究表明[3-6]，加強日常訓(xùn)練，模擬戰(zhàn)場環(huán)境訓(xùn)練，綜合衛(wèi)生心理訓(xùn)練，改善機體營養(yǎng)狀況及傷后心理護理，均可提高機體應(yīng)激適應(yīng)能力。

眾所周知，應(yīng)激反應(yīng)是把“雙刃劍”，一般情況下的應(yīng)激反應(yīng)是對人有利的，但長時間過于強烈的應(yīng)激反應(yīng)會給人帶來損傷。臨床上因重型損傷導(dǎo)致的應(yīng)激性消化潰瘍較為常見。目前研究表明，腸的應(yīng)激性損傷主要與腦-腸軸相關(guān)，而較早所認(rèn)知的下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)（HPA軸），內(nèi)臟高敏效應(yīng)、精神心理等因素可能僅是其在胃腸道應(yīng)激作用中的具體表現(xiàn)[7-10]。胃腸道直接或間接的受中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)的共同支配[11-12]，并通過共同的遞質(zhì)——腦腸肽，建立起腦-腸軸調(diào)節(jié)的通路。已證實的腦腸肽包括組胺、5-羥色胺（5-HT）、一氧化氮（NO）、去甲腎上腺素（NE）、神經(jīng)降壓素（NT）、P 物質(zhì)（SP）、降鈣素相關(guān)肽（CGRP）、血管活性腸肽（VIP）等[13]。這些物質(zhì)通過直接或間接影響胃腸平滑肌蠕動、血管的收縮、腺體的分泌實現(xiàn)對胃腸道的作用。較為深入地研究腦-腸軸的關(guān)系，明確腦腸肽在導(dǎo)致腸應(yīng)激損傷通路中的節(jié)點，可確定藥物治療的新靶點，為探索新的預(yù)防與治療方法提供思路。

NMDAr1是一種興奮性氨基酸的特異性離子型受體，主要分布于大腦皮質(zhì)、丘腦、紋狀體、海馬等的突出后膜上，此外其在脊髓背角運動神經(jīng)元軸突中也有分布，并延伸到內(nèi)臟神經(jīng)末梢。目前研究表明，其與應(yīng)激反應(yīng)主要的通路HPA軸有著密切的關(guān)系[14]。本實驗結(jié)果顯示，隨著兔的腸應(yīng)激性病理改變的加重，NMDAr1在腸內(nèi)的免疫組織化學(xué)表達量逐步增加。而Varga G等[15]研究證實，通過抑制NMDAr1受體可降低腸炎模型小鼠的炎癥反應(yīng)，表明NMDAr1參與了爆炸及爆炸應(yīng)激狀態(tài)下腸組織病理損傷過程。其可能的作用機制有以下幾個方面：①中樞的NMDAr1通過激活HPA軸促進腎上腺皮質(zhì)激素的分泌和釋放，介導(dǎo)炎癥應(yīng)激反應(yīng)[16]。葉建寧等[17]通過測定嚴(yán)重燙傷小鼠海馬NMDAr1受體的表達研究認(rèn)為，NMDAr1減弱了腎上腺皮質(zhì)激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而引起腎上腺皮質(zhì)激素大量分泌。②NMDAr1通過降低胃黏膜VCL的表達，導(dǎo)致胃黏膜組織屏障發(fā)生變化，使胃酸、胃蛋白酶等更容易破壞黏膜的完整性[18]。③外周NMDAr1受體增強外周高敏化[19]，Du J等[20]應(yīng)用電生理學(xué)單纖維記錄方法發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)下給予NMDAr1可以誘發(fā)27%左右的C纖維放電，而在足底注射CFA后，NMDAr1誘發(fā)C纖維放電的概率（86%）和頻率顯著增加，并且誘發(fā)傷害性感受器放電所需的NMDAr1閾值濃度也較正常狀態(tài)明顯下降。痛閥的降低使應(yīng)激變的更加敏感，應(yīng)激的強度相應(yīng)增高。④外周NMDAr1受體增強了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。在炎癥和損傷情況下，外周傷害性感受器持續(xù)受到刺激，導(dǎo)致中樞終末釋放的神經(jīng)遞質(zhì)增多，引起脊髓背角突觸后神經(jīng)元超興奮，該神經(jīng)元將超興奮的信息繼續(xù)向上傳遞到腦中樞從而產(chǎn)生慢性痛[21]。持續(xù)的慢性疼痛導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)時間增長，炎癥加重。

通過本實驗結(jié)果可以清晰觀察到，兔的腸病理結(jié)構(gòu)改變由輕到重時，NMDAr1的表達量也由（+）增加至（++++），這也佐證了目前對于NMDAr1的研究，NMDAr1在低水平量時，其介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)，起到自我保護作用，當(dāng)其超過保護機制的臨界點時，將損傷機體。由此，一旦確定NMDAr1損傷機體的扳機點，將有可能在其介導(dǎo)炎癥前，采取阻斷措施，從而減輕對機體的損傷。可見今后對于NMDAr1介導(dǎo)炎癥通路及其扳機點的探討，或者針對更加廣泛的全身應(yīng)激反應(yīng)綜合征的多通路、多指標(biāo)的探討，對于預(yù)防治療應(yīng)激性病變將產(chǎn)生不可估量的作用。

[1]林也容，張建華，郁毅剛，等.山地團進攻制式火炮打擊兔應(yīng)激防護模型血清自由基變化實驗研究[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，11（15）：1167-1169.

[2]林也容，張?zhí)m，李娟，等.火炮打擊兔應(yīng)激防護模型卵巢病理及P38表達的形態(tài)學(xué)研究[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，12（18）：1437-1439.

[3]王新興，錢令嘉，冷雪，等.不同訓(xùn)練強度士兵的應(yīng)激適應(yīng)能力[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2004，22（3）：171-173.

[4]李敏，李彥章，黃梅園，等.軍事演習(xí)應(yīng)激對野戰(zhàn)部隊官兵心理和情緒的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，29（19）：1894-1895.

[5]趙秋玲，楊全峰，李曉明.急進駐高原官兵胃腸道應(yīng)激反應(yīng)的營養(yǎng)干預(yù)研究[J].臨床軍醫(yī)雜志，2011，39（6）：1147-1149.

[6]甘元瓊.心理護理在當(dāng)代護理工作中的運用和作用[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2009，16（15）：117-119.

[7]TachéY，Perdue MH.Role of peripheral CRF signalling pathways instress-related alterations of gut motility and mucosal function[J].Neurogastroenterol Motil，2004，16（1）：137-142.

[8]Stengel A，TachéY.Corticotropin-releasing factor signaling and visceral response to stress[J].Exp Biol Med （Maywood），2010，235（10）：1168-1178．

[9]王敬東.腦-腸互動在腸易激綜合征發(fā)病中的作用[J].世界華人消化雜志，2006，14（34）：3299-3301.

[10]李寧寧，方秀才.腦-腸軸在腸易激綜合征發(fā)病中的作用[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22（2）163-166.

[11]Giaroni C，Zanetti E，Chiaravalli AM，et al.Evidence for a glutamatergic modulation of the cholinergic function in the human enteric nervous system via NMDA receptors[J].Eur J Pharmacol，2003，476（1-2）：63-69.

[12]Liu MT，Rothstein JD，Gershon MD，et al.Glutamatergic enteric neurons[J].JNeurosci，1997，17（12）：4764-4784.

[13]Varga G，Balint A，Burghardt B，et al.Involvement of endogenous CCK and CCK1 receptors incolonic motor function[J].Br J Pharmacol，2004，141（8）：1275-1284.

[14]陸建華，黎海蒂，高京生.燙傷大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體亞型基因表達的變化[J].中華燒傷雜志，2002，18（3）：180-182.

[15]Varga G，魪rces D，F(xiàn)azekas B，et al.N-Methyl-D-aspartate receptor antagonism decreases motility and inflammatory activation in the early phase of acute experimental colitis in the rat[J].Neurogastroenterol Motil，2010，22（2）：217-225.

[16]張慶宇，房明.應(yīng)激反應(yīng)中腎上腺激素的作用[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2009，16（8）：184-185.

[17]葉建寧，陸建華，熊加祥.海馬NMDAr1受體調(diào)節(jié)嚴(yán)重燙傷應(yīng)激后HPA軸興奮性的相關(guān)機制研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（10）：982-985.

[18]高會軍，黃裕新，王勝智，等.應(yīng)激對大鼠胃粘膜VCL和海馬NMDAr1R2 表達的影響[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，43（10）：727-803.

[19]Gaudreau GA，Plourde V.Involvement of N-methyl-d-aspartate（NMDA） receptors in a rat model of visceral hypersensitivity[J].Behav Brain Res，2004，150（1-2）：185-189.

[20]Du J，Zhou S，Coggeshall RE，et al.N-methyl-D-aspartate-induced excitation and sensitization of normal and inflamed nociceptors[J].Neuroscience，2003，118（2）：547-562．

[21]Woolf CJ，Salter MW.Neuronal plasticity：increasing the gain in pain[J].Science，2000，288（5472）：1765-1769.