超聲對鼻咽癌拓撲替康熱化療的增效作用研究

林盛，饒明月，吳敬波

（瀘州醫學院臨床醫學院附屬醫院腫瘤科，瀘州 646000）

鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤之一，嚴重威脅生命健康，同步放化療是中晚期鼻咽癌的標準治療模式。拓撲替康（topotecan，TPT）是喜樹堿類半合成衍生物，水溶性好，臨床治療證實其可以作為肺［1］、卵巢［2］等惡性腫瘤的二線使用方案，在鼻咽癌［3］的治療中也有較好療效。熱化療是一種綠色腫瘤治療模式，增加患者對化療藥物敏感性，更能有效地殺傷惡性腫瘤細胞的同時減輕化療產生的毒副作用［4］。超聲波因其獨特的理化性質，通過改變細胞膜的通透性而增加藥物濃度，具備與熱療相似的增效功能，兩者之間的差異目前報道較少。因此，本研究以人鼻咽癌細胞株（CNE－2）為對象，觀察超聲是否對TPT的熱化療殺傷效能有促進作用，并結合電鏡對各組細胞的亞細結構損傷性改變進行觀察，旨在為超聲聯合熱化療治療鼻咽癌提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TPT粉針（黃石飛云），超聲理療儀（美國CHATTAHOOGA 公司），CCK－8試劑盒（碧云天），透射電子顯微鏡（日本株式會社），酶標儀（美國BIO－RAD公司）。

1.2 細胞及培養

CNE－2，完全培養基，37℃、5%CO2孵箱常規培養。

1.3 半數抑制濃度（IC50）測定

1.3.1 拓撲替康處理及CCK8測定 貼壁細胞胰酶消化后重懸，調整濃度為5×104／mL，接種96孔板，每孔100μL細胞懸液，置恒溫孵箱內培養貼壁，分別加入TPT 20μL，濃度依次為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg／mL，每組3個復孔；作用1 h后，加入CCK8工作液10μL／孔，孵育2h，送檢酶標儀（波長450nm）得到OD值，重復3遍后計算IC50。

1.3.2 IC50的計算 抑制率＝（1－實驗組 OD值／對照組OD值）×100%，以加藥濃度的對數作為X，將生長抑制率作為Y，線形回歸后算出抑制率是50%時的加藥濃度，即IC50。

1.4 制備細胞懸液

對數生長期細胞經胰酶消化，離心后重懸，調節濃度5×104個／mL，分設單純超聲組、單純TPT組、單純熱療組、熱療＋TPT組、超聲＋TPT熱化療組及空白對照組（TPT工作濃度0.08μg／mL，取IC50的20%）。

1.5 超聲處理

超聲處理依據超聲理療儀的性質，探頭面積為1cm2，采用連續波，操作時加少許凡士林使凍存管底部與探頭接觸緊密，作用1min，重復實驗3次。

1.6 熱療處理

采用電熱恒溫水浴箱加熱（溫度波動＜±0.1℃），先將1只500mL燒杯用鉛塊固定于恒溫水浴箱底部，內盛1.5 cm水共同升溫至37℃，將熱療＋TPT組、單純熱療組、超聲＋TPT熱化療組3管捆縛一起置于燒杯底部加熱至43℃，恒溫處理1h，重復實驗3次。

1.7 電鏡觀察

單純超聲組、單純TPT組、單純熱療組、熱療＋TPT組、超聲＋TPT熱化療組，各抽取0.5mL細胞懸液于EP管，1 000r／min離心5min，細胞沉淀用戊二醛固定后電鏡觀察細胞亞細結構。

1.8 統計學處理

采用SPSS 12.0軟件進行完全隨機方差分析，檢驗標準為α＝0.05。

2 結果

2.1 細胞培養

CNE－2細胞呈貼壁生長，形態大小各異，核大有分裂，進入對數生長期后隔天傳代（見圖1）。

2.2 IC50結果

測得OD值計算抑制率，利用直線回歸計算出抑制率為50%時的藥物濃度即IC50，取3次實驗的平均值得出TPT對CNE－2的IC50為0.396μg／mL。

2.3 超聲聯合

熱療聯合TPT對CNE－2的抑制作用：單一處理因素間比較，熱療對細胞株的抑制作用與藥物組相當，明顯強于超聲組，組間比較差異有統計學意義（P＜0.01）。熱化療組、超聲＋TPT熱化療組對細胞的抑制作用逐漸增強，組間比較差異有統計學意義（P＝0.000＜0.01）（見表1）。

2.4 電鏡結果

2.4.1 對照組與單純藥物組的電鏡圖像 對照組電鏡顯示：細胞的核質疏松，胞質中線粒體及內質網結構顯示清楚，分裂核象，說明細胞的增殖能力強（見圖2）。單純藥物組電鏡顯示：細胞核中異染色質增多并伴染色質固縮使胞核縮小，重要細胞器有損傷性改變，增殖能力受到抑制（標記為蔥皮樣改變的髓樣結構，提示線粒體或內質網功能出現不可逆損傷性改變，見圖3）。

圖1 CNE－2細胞（×200）（傳代培養后第4天）

表1 超聲聯合TPT熱化療對CNE－2的抑制效應

2.4.2 單純超聲／熱療組電鏡圖像 單純超聲組電鏡顯示：細胞核固縮，線粒體和內質網結構呈現水腫樣改變（箭頭所示，可逆損傷），提示細胞增殖能力有減弱（見圖4）。單純熱療組電鏡顯示：細胞核回縮，在核膜周邊出現大量高密度異染色質沉積，細胞增殖能力明顯抑制（見圖5）。

2.4.3 超聲聯合TPT熱化療電鏡圖像 熱療聯合TPT電鏡圖像：細胞核中異染色質明顯增多，電子密度高，核／質比明顯減少伴線粒體減少趨勢及髓樣結構出現（箭頭所示），增殖能力明顯減弱（見圖6）。超聲聯合TPT熱化療電鏡圖像：線粒體水腫明顯或者消失，胞質內有大量的空泡結構出現（為細胞器破壞后表現），核質固縮裂解，細胞出現凋亡、壞死趨勢（見圖7）。

3 討論

鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤，同步放化療是中晚期鼻咽癌的標準治療模式。篩選有效的化療藥物作為聯合手段能為放療增益。課題組前期致力研究喜樹堿類藥物在鼻咽癌治療中的作用，證實其對鼻咽癌有放射增敏效能［5］。超聲的抗瘤效應最早由Szent－Gy?rgyi等［6］在1933年在動物腫瘤模型上證實。隨后的研究［7－9］揭示了其可能的抗瘤機制，主要包括空化效應及輻射沖擊，使皮膚黏膜或細胞膜的通透性發生改變，從而增加細胞對藥物的攝取量，增強對靶細胞的殺傷。大量研究表明，高溫能增強某些化療藥物的細胞毒作用，在42℃作用2h能使一些化療藥物抗癌效果增強10～100倍，其作用機制首先是直接的細胞毒作用，熱療的靶器官是細胞膜，加熱后細胞膜的主要成分，如磷脂質等受到影響，質膜的流動性和通透性均發生改變；其次，加熱改變膜的通透性利于化學藥物的滲透和吸收，增加細胞對藥物的攝取量使腫瘤細胞內藥物濃度提高；高溫能抑制藥物引起的腫瘤細胞損傷修復，如減少DNA的斷裂修復和DNA合成。其他機制［10］包括抑制熱休克蛋白（HSP）的累積及使藥物反應速度加快，增加溫度依賴藥物抗腫瘤活性。

綜合以上研究背景，本實驗探討超聲能否對TPT的熱化療殺傷效應起到促進作用。結果證實，熱療聯合TPT后加強了藥物的殺傷效應，在相同的藥物作用時間前提下，熱化療組對鼻咽癌細胞的抑制效應是強于單純藥物組的；通過電鏡對處理后細胞的亞細結構觀察，熱化療組的細胞分裂增殖能力明顯弱于單純藥物組，細胞器受到更為嚴重的損傷，說明熱療對TPT有增效作用。超聲聯合后使TPT熱化療殺傷效應進一步提高，細胞器消亡，細胞處于凋亡壞死狀態，說明超聲對TPT熱化療殺傷有增效作用。超聲是一種波動形式，其振動可引起生物大分子、細胞及組織結構處于激烈的機械運動場中，使其結構功能發生變化；超聲波也是一種能量形式，引起細胞膜損傷或增強溶酶體活性及蛋白質損傷而使細胞死亡。由于組織小氣泡的存在，超聲可引起微小氣泡或其周圍溫度升高，產生的氧自由基及高速微熱流使細胞受到嚴重的損傷乃至破壞［11］。

超聲可以作為增效手段為鼻咽癌患者的治療帶來福音，但同時也存在一些問題如超聲作用時間長短及強度是否會影響其增益作用，對藥物的促滲有無特指性和局限性，有無可能改善化療藥物的耐藥及可能的分子機制等都尚待進一步研究加以確認。

［1］Jotte R，Conkling P，Reynolds C，et al.Randomized phase II trial of single－agent amrubicin or topotecan as second－line treatment in patients with small－cell lung cancer sensitive to first－line platinum－based chemotherapy ［J］.J Clin Oncol，2011，29（3）：287－293.

［2］Tsunetoh S，Terai Y，Sasaki H，et al.Effect of a topoisomerase－1inhibitor （topotecan）on the efficacy of cisplatin in in vitro and in vivo platinum－resistant ovarian cancer models［J］.J Clin Oncol，2010，28（15suppl）：e13160.

［3］何麗佳，吳敬波，文慶蓮.拓撲替康不同時間給藥對人鼻咽癌細胞放射增敏作用的實驗研究［J］.臨床腫瘤學雜志，2010，15（6）：511－513.

［4］Huang T，Gong W，Li X，et al.Enhancement of osteosarcoma cell sensitivity to cisplatin using paclitaxel in the presence of hyperthermia［J］.Int J Hyperthermia，2013，29（3）：248－255.

［5］吳敬波，文慶蓮，范娟，等.拓撲替康對鼻咽癌放射增敏的體內實驗［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2007，14（2）：82－85.

［6］Szent－Gy?rgyi A. Chemical and biological effects of ultrasounic radiation［J］.Nature，1933，130：131－278.

［7］Hagtvet E，Evjen TJ，Olsen DR，et al.Ultrasound enhanced antitumor activity of liposomal doxorubicin in mice ［J］.J Drug Target，2011，19（8）：701－708.

［8］Rapoport N，Nam KH，Gupta R，et al.Ultrasound－mediated tumor imaging and nanotherapy using drug loaded，block copolymer stabilized perfluorocarbon nanoemulsions ［J］.J Control Release，2011，153（1）：4－15.

［9］Knowles J，Sorace A，Heath CH，et al.Ultrasound therapy boosts drug toxicity in vitro and in vivo ［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2011，145（2suppl）：77－78.

［10］Polat BE，Hart D，Langer R，et al.Ultrasound－mediated transdermal drug delivery：mechanisms，scope，and emerging trends［J］.J Control Release，2011，152（3）：330－348.

［11］Zhang XL，Hu AB，Cui SZ，et al.Thermotherapy enhances oxaliplatin－induced cytotoxicity in human colon carcinoma cells［J］.World J Gastroenterol，2012，18（7）：646－653.