山楂醇提物灌胃對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的保護(hù)作用

秦繼勇，李文輝△，徐進(jìn)彥，劉建波，王曙光，王承紅，常 莉

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(云南省腫瘤醫(yī)院)腫瘤放射治療中心，昆明 650118;2.云南省腫瘤研究所腫瘤放射治療研究中心，昆明 650118;3.云南省中醫(yī)藥研究所，昆明 650118)

山楂為薔薇科植物山里紅(Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂 C.pinnatifuta Bge)的干燥成熟果實(shí)，性味酸、甘、微溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具行氣散瘀、止痛、消食化積功能。作為常用的中藥材，急、慢性毒理試驗(yàn)證明，其藥用安全可靠，無(wú)任何毒副作用［1］。本文主要研究山楂醇提物灌胃對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 試劑與儀器

RPMI-1640(GIBCO公司生產(chǎn)，批號(hào)1296119)、高氯酸(高天津鑫源化工廠，批號(hào)20041208)、苦味酸(廣東合山化工廠，批號(hào)20041105)、氯化鈣(成都金山化工試劑廠，批號(hào)040326)、冰醋酸(重慶川江化學(xué)試劑廠，批號(hào)20040407)、福爾馬林(成都金山化工試劑廠，批號(hào)900704)、瓦里安直線加速器(型號(hào)2100C)、離心機(jī)(國(guó)產(chǎn)，型號(hào)TGL-168)、普通光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，型號(hào)CX-31)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Sysmex公司，型號(hào) KX-21N)、分光光度計(jì)(Kyoto公司，型號(hào) UV-190)、電子天平(Sartorius公司，型號(hào)BP3100S)、烘箱(國(guó)產(chǎn)，型號(hào)2002020001)等。

1.2 動(dòng)物

健康SPF級(jí)昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量20±2g，6～8周齡，由昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供。

1.3 藥物

山楂由云南省中醫(yī)中藥研究所提供(產(chǎn)地河北)，在云南大學(xué)天然藥物教研室進(jìn)行提取:將1000克成熟帶皮山楂在高溫下干燥，然后研成粉末，浸泡于4000ml75%水合甲醇溶液中并進(jìn)行振蕩1h，隨后在室溫下放置72h后進(jìn)行過(guò)濾，將濾液在40℃條件下減壓干燥，得到山楂醇提物中有效活性成分的水合物，然后在低溫條件下進(jìn)行凍干，得到粉狀提取物，制成含生藥濃度為0.5g/ml的醇提液，置于4℃冰箱保存待用。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

將50只小鼠按體重分層隨機(jī)抽樣分成5組，即:正常對(duì)照組(control組)、單純照射組(IR組)、低劑量給藥+照射組(LD+IR組)、中劑量給藥 +照射組(MD+IR組)、高劑量給藥 +照射組(HD+IR組)，每組各10只。

2.2 給藥劑量及方式

山楂醇提物按小鼠體重將實(shí)驗(yàn)藥物分別給予HD5g/kg(用生理鹽水稀釋為0.2ml，灌胃給藥，下同)+IR組、MD組2.5g/kg+IR、LD組1.25g/kg+IR，control組和IR組分別灌0.2ml的生理鹽水。

2.3 實(shí)驗(yàn)流程

第1天將50只小鼠稱(chēng)重、標(biāo)記，然后以相應(yīng)濃度溶液灌胃(control組和IR組灌生理鹽水，LD+IR組、MD+IR組、HD+IR組分別灌相應(yīng)濃度受試藥物)，連續(xù)灌胃12d;分別在第6、12天將各組小鼠稱(chēng)重后斷尾取血送檢，第6天取血1h后所有小鼠送云南省腫瘤醫(yī)院放療中心一次性全身照射6Gy的X射線(加速器輸出劑量率600mu/min);在第18天將各組小鼠稱(chēng)重后股靜脈取血送檢，然后頸椎脫臼處死小鼠，取骨髓測(cè)定骨髓DNA含量、骨髓有核細(xì)胞數(shù)。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 體重 所有小鼠采用電子天平稱(chēng)重并記錄結(jié)果。

2.4.2 血象分析 每次取血約250μL，滴入抗凝管中，送云南省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，測(cè)定靜血中的RBC、WBC、PLT、血紅蛋白含量。

2.4.3 骨髓DNA含量測(cè)定 頸椎脫臼處死小鼠，解剖小鼠取左側(cè)股骨，除凈肌肉組織，用5mmol/L CaCl210ml將全部骨髓沖入離心管中，4℃冰箱放置30min，然后 2500r/min離心 15min，棄上清液。沉淀中加入5ml 0.2mol/L HClO4，將沉淀物充分混勻，90℃水浴加熱15min，冷卻過(guò)濾，濾液用 UV-190型分光光度計(jì)在268nm處測(cè)定吸光度A值［2］，按下列公式計(jì)算每根股骨所含DNA(ug):DNA(ug)=40×50×A268。

2.4.4 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù) 頸椎脫臼處死小鼠，解剖小鼠取右側(cè)股骨，除凈肌肉組織，用7號(hào)針頭刺穿股骨末端，再用10mlRPMI-1640液沖洗骨髓，直至股骨沖為白色為止(10遍以上)，將沖出的骨髓液通過(guò)4號(hào)針頭過(guò)濾待用，取0.5ml4%乙酸及0.5ml骨髓液于另一試管中混勻，放置2min再次混勻，然后取少許滴入計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下常規(guī)計(jì)數(shù)有核細(xì)胞［3］，有核細(xì)胞數(shù)(ml)=4個(gè)大方格有核細(xì)胞總數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)。

2.5 輻射條件及劑量 云南省腫瘤醫(yī)院放療中心瓦里安直線加速器6MV-X射線，給予各照射組小鼠一次全身照射劑量6Gy。

3 結(jié)果

3.1 山楂醇提物對(duì)輻射損傷小鼠體重影響

表1顯示，給藥前各組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給藥5d后，各組體重均有不同程度的增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);給藥 +照射5d后，control組體重繼續(xù)增加，而各照射組體重較前下降，IR組與 control組比較明顯下降(P＜0.05)，但各給藥+IR組與IR組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。照射12d后，control組體重繼續(xù)增加，IR組體重變化不大，各給藥+IR組體重出現(xiàn)明顯回升，其中以HD+IR組最為明顯;IR組與 control組比較明顯下降(P＜0.05)，各給藥+IR組與IR組比較明顯上升(P＜0.05)。

表1 不同時(shí)間段各組體重變化(±s，g)

表1 不同時(shí)間段各組體重變化(±s，g)

注:與control組比較:*P＜0.05;與IR組比較:★P＜0.05

組 別 例數(shù) 給藥前(第1天)給藥5d后(第6天)給藥+照射5d后(第12天)照射12d后(第18天).5074 23.4700±0.8890 IR 組 10 18.3500±0.6177 19.7260±0.5362 18.5964±0.6403* 18.8780±1.1025*LD+IR組 10 19.1250±0.5425 20.9129±0.3264 18.7110±0.8918 20.7400±0.9510★MD+IR組 10 18.4860±0.5181 20.8985±0.3961 19.4782±0.6417 22.1483±1.0668★HD+IR組 10 18.9552±0.2345 21.8505±0.3678 20.1555±0.6130 22.7018±0.4671 control 組 10 18.1470±0.6062 19.2850±0.6209 23.0785±0★

3.2 山楂醇提物對(duì)輻射損傷小鼠白細(xì)胞影響

表2顯示，給藥前各組白細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給藥5d后，各組白細(xì)胞均有不同程度的增加，但亦差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);給藥+照射5d后，control組白細(xì)胞無(wú)明顯變化，而各照射組白細(xì)胞較前急劇下降，IR組與control組比較顯著下降(P＜0.01)，但各給藥+IR組與IR組下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);照射12d后，control組白細(xì)胞仍無(wú)明顯變化，IR組白細(xì)胞較前繼續(xù)下降，各給藥+IR組白細(xì)胞較前亦繼續(xù)下降，但程度較IR組趨緩，其中以HD+IR組降幅最小，IR組與control組比較顯著下降(P＜0.01)，但各IR+給藥組與 IR組下降比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 不同時(shí)間段各組白細(xì)胞變化(±s，×109/L)

表2 不同時(shí)間段各組白細(xì)胞變化(±s，×109/L)

注:與 control組比較:＊＊P ＜0.01

組 別 例數(shù) 給藥前(第1天)給藥5d后(第6天)給藥+照射5d后(第12天)照射12天后(第18天)control 組 10 7.8900±0.6303 8.7250±0.8338 8.8229±1.68 41 1.7200±0.3006 17 8.9182±0.6685 IR 組 10 8.2200±0.7563 10.1648±1.0775 1.5058±0.1777＊＊ 0.9396±0.1641＊＊LD+IR組 10 8.8900±1.416 8.9625±0.8798 1.8364±0.5130 1.3364±0.4549 MD+IR組 10 8.5400±0.9315 9.7300±1.0603 1.9467±0.1638 1.4200±0.2918 HD+IR組 10 8.8800±0.8301 9.5700±1.0874 1.9818±0.33

3.3 山楂醇提物對(duì)輻射損傷小鼠紅細(xì)胞的影響

表3顯示，給藥前各組紅細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給藥5d后，各組紅細(xì)胞均有不同程度的增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);給藥+照射5d后，control組紅細(xì)胞繼續(xù)增加，而各照射組紅細(xì)胞較前下降，IR組與 control組比較明顯下降(P＜0.05)，但各給藥+IR組與IR組下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);照射12d后，control組紅細(xì)胞無(wú)明顯變化，IR組紅細(xì)胞較前繼續(xù)下降，各給藥+IR組紅細(xì)胞較前亦繼續(xù)下降，但程度較IR組趨緩，其中以HD+IR組降幅最小，IR組與control組比較明顯下降(P＜0.05)，但各給藥+IR組與IR組下降比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 不同時(shí)間段各組紅細(xì)胞變化(±s，×1012/L)

表3 不同時(shí)間段各組紅細(xì)胞變化(±s，×1012/L)

注:與 control組比較:*P＜0.05

組 別 例數(shù) 給藥前(第1天)給藥5d后(第6天)給藥+照射5d后(第12天)照射12天后(第18天)control 組 10 7.9270±0.3156 9.2862±0.2695 10.2850±0.3 86 7.4582±0.3960 237 10.4691±0.2418 IR 組 10 8.3200±0.3472 9.1863±0.2525 8.2500±0.3899* 6.7062±0.3816*LD+IR組 10 7.2960±0.3189 9.2587±0.1939 8.2620±0.4788 6.7460±0.4134 MD+IR組 10 7.9040±0.4268 9.2680±0.2410 8.3373±0.2347 7.1655±0.3925 HD+IR組 10 8.0700±0.5078 9.2280±0.2086 8.3836±0.51

3.4 山楂醇提物對(duì)輻射損傷小鼠血小板影響

表4顯示，給藥前各組血小板差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給藥5d后，各組血小板數(shù)較前均增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);給藥+照射5d后，control組血小板繼續(xù)增加，而各照射組血小板較前下降，IR組與control組比較明顯下降(P＜0.05)，但各給藥+IR組與IR組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);照射12d后，control組血小板無(wú)明顯變化，各照射組血小板較前繼續(xù)下降，但各給藥+IR組血小板下降程度較IR組趨緩，其中以HD+IR組降幅最小，IR組與control組比較顯著下降(P＜0.01)，而各給藥+IR組與IR組下降比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表4 不同時(shí)間段各組血小板變化(±s，×109/L)

表4 不同時(shí)間段各組血小板變化(±s，×109/L)

注:與 control組比較:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 例數(shù) 給藥前(第1天)給藥5d后(第6天)給藥+照射5d后(第12天)照射12天后(第18天)control 組 10 841.1111± 73.7986 1088.625±71.5802 1370..600±64.2217 492.0000±86.4921 0000±73.8426 1363.2730±74.8522 IR 組 10 836.0000±112.1792 1026.632±55.1651 947.3330±81.6045* 464.1538±55.1583＊＊LD+IR組 10 855.6000±122.0622 1078.250±88.7883 971.3333±90.5711 468.3333±73.3038 MD+IR組 10 840.2222±99.8056 1139.000±67.8360 998.1429±59.5025 486.0000±88.4437 HD+IR組 10 862.5000±100.3628 1224.000±54.8796 1073

3.5 山楂醇提物對(duì)輻射損傷小鼠血紅蛋白含量的影響

表5顯示，給藥前各組血紅蛋白含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給藥5d后，各組血紅蛋白含量均有不同程度的增加，但亦差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);給藥 +照射5d后，control組血紅蛋白含量變化不明顯，而各照射組血紅蛋白含量較前急劇下降，其中以IR組血紅蛋白含量下降最為明顯，IR組與control組比較顯著下降(P＜0.01)，LD+IR組與IR組下降差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但 MD+IR組和HD+IR組與IR組比較明顯上升(P＜0.05);照射12d后，control組血紅蛋白含量仍無(wú)明顯變化，各照射組血紅蛋白含量較前有所回升，其中以HD+IR組最為明顯，IR組與control組比較顯著下降(P＜0.01)，LD+IR組與 IR組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但MD+IR組和HD+IR組與IR組比較明顯上升(P＜0.05)。

3.6 山楂醇提物對(duì)輻射損傷小鼠骨髓DNA含量、骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響

表6顯示，照射12d后，IR組骨髓 DNA含量與control組比較明顯下降(P＜0.05)，各給藥+IR組骨髓DNA含量與IR組比較明顯上升(P＜0.05)。照射12d后，IR組骨髓有核細(xì)胞數(shù)與control組比較明顯下降(P＜0.05)，LD+IR組骨髓有核細(xì)胞數(shù)與IR組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但MD+IR組和HD+IR組與IR組比較明顯上升(P＜0.05)。

表5 不同時(shí)間段各組血紅蛋白含量變化(±s，g/L)

表5 不同時(shí)間段各組血紅蛋白含量變化(±s，g/L)

注:與 control組比較:＊＊P＜0.01;與 IR組比較:★P＜0.05

組 別 例數(shù) 給藥前(第1天)給藥5d后(第6天)給藥+照射5d后(第12天)照射12天后(第18天)control 組 10 138.6000±5.7295 159.0000±4.4234 158.0000±4.1763 156.5455± 2.9057 IR 組 10 143.4000±5.2328 158.4211±4.5642 93.8000±5.9345＊＊ 95.2000± 5.4259＊＊LD+IR組 10 126.8000±4.9008 160.8750±3.4252 99.0000±4.4240 104.0000±11.3666 MD+IR組 10 138.2000±7.7371 158.3000±3.7396 119.5714±2.4556★ 124.0000± 6.3509★HD+IR組 10 137.2000±6.9167 160.2000±3.6213 123.1111±7.2274★ 129.7778± 8.1816★

表6 不同劑量組照射12天后骨髓DNA含量、有核細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(±s)

表6 不同劑量組照射12天后骨髓DNA含量、有核細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(±s)

注:與control組比較:*P＜0.05;與IR組比較:★P＜0.05

組 別 例數(shù) 骨髓DNA含量(ug/根)骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)( ×105個(gè)/根)control 組10 1.5123±0.0918 29.4000±4.4801 IR 組 10 1.1986±0.0595* 17.7000±3.2594*LD+IR組 10 1.4344±0.0824★ 19.0000±3.2007 MD+IR組 10 1.4290±0.0698★ 28.3333±6.6729★HD+IR組 10 1.5736±0.0936★ 28.8182±6.6794★

4 討論

國(guó)內(nèi)對(duì)于中藥作為放射防護(hù)劑的研究，從20世紀(jì)50年代后期開(kāi)始。中草藥具有藥源廣、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，許多中草藥具有抑制自由基的產(chǎn)生、增強(qiáng)自身的抗氧化能力、提高機(jī)體的免疫功能、保護(hù)造血系統(tǒng)、減輕DNA損傷、增強(qiáng)DNA修復(fù)等功能。特別是日本和韓國(guó)在開(kāi)發(fā)抗輻射天然藥物方面取得了可喜的成績(jī)，如人參、靈芝、當(dāng)歸、白芍藥、川芎、四物湯等，由于療效確切、無(wú)毒且能增強(qiáng)人體免疫力，有較好的實(shí)際應(yīng)用前景。

近代藥理研究發(fā)現(xiàn)［4，5］，山楂提取物中含有多種黃酮類(lèi)和三萜類(lèi)(山楂酸、熊果酸、齊敦果酸、苦杏仁甙、槲皮素、皂甙等)活性成分，還有蘋(píng)果酸、檸檬酸等多種果酸及較多維生素成分，其中大部分成分具有抗氧化作用。其中黃酮能促進(jìn)超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成，對(duì)羥自由基所致的多種細(xì)胞損傷都有不同程度的保護(hù)作用［6］;三萜類(lèi)活性成分中的皂甙能抑制鈣通道，顯著抑制黃嘌呤，即次黃嘌呤氧化酶所致的自由基增多，還能明顯抑制血清及腎皮質(zhì)的脂質(zhì)過(guò)氧化，并提高兩者的 SOD和谷胱苷肽過(guò)氧化物酶活性［7，8］;槲皮素有清除O2、OH和單線態(tài)氧等活性氧的能力，能有效保護(hù)生物膜免受自由基的損害［9］。

本研究采用經(jīng)典動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，對(duì)昆明種小鼠在天然藥物山楂醇提物低劑量1.25g/kg/d、中劑量2.5g/kg/d、高劑量5g/kg/d灌胃下，接受 6Gy的 X射線一次全身照射后，觀察受試藥物不同劑量對(duì)照射小鼠的體重、外周血象、骨髓DNA含量及有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾集落形成和胸腺、脾指數(shù)的影響;發(fā)現(xiàn)不同劑量的山楂醇提物組與IR組比較，各給藥+照射組的體重、血紅蛋白、骨髓DNA含量、骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯升高，2組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中均以HD(高劑量)+IR組升高最為明顯;外周血中 RBC、WBC、PLT比較，各照射組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨給藥劑量的增加，各給藥+照射組的上述指標(biāo)較IR組均有遞增趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山楂醇提物具有增加輻射損傷小鼠體重、顯著升高照射后小鼠血紅蛋白、骨髓DNA含量、骨髓有核細(xì)胞數(shù)的作用。本研究與國(guó)內(nèi)外報(bào)道［10，11］山楂提取物注入小鼠腹腔能有效保護(hù)輻射后小鼠的骨髓損傷，促進(jìn)外周血白細(xì)胞、血小板數(shù)的恢復(fù)有類(lèi)似的研究結(jié)果。這與山楂的健脾、開(kāi)胃及其成分中的抗氧化活性物質(zhì)能有效清除輻射產(chǎn)生的各種自由基、保護(hù)細(xì)胞生物膜的正常代謝作用有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)各照射組之間的外周血象差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與小鼠所受照射劑量及劑量率過(guò)大、成熟血細(xì)胞破壞后造血干細(xì)胞分裂延遲、釋放減少有關(guān)。但各劑量+照射組亦有隨劑量增加而血細(xì)胞增多的趨勢(shì)，其中以大劑量組效果最為明顯。有關(guān)山楂醇提物對(duì)輻射保護(hù)的作用機(jī)制、作用靶點(diǎn)、有效成分、劑量及用藥最佳時(shí)機(jī)都有待進(jìn)一步深入研究。

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