黃芪葛根湯對2型糖尿病大鼠心肌病變的影響＊

陳艷芬，李衛民，高 英△，吳清和，唐春萍，楊超燕，陶曙紅

(1.廣東藥學院中藥學院，廣州 510006;2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣州 510006)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種獨立于冠心病、高血壓、先心病和其他類型心臟病之外的特異心臟病變，是導致糖尿病患者心衰的重要原因［1］，其病理改變主要表現為心肌細胞肥大、凋亡、灶性壞死和心肌間質纖維化。該病臨床上很難早期發現，發病機制尚未完全明了，預防和治療仍不完善，因此動物模型報道不多。臨床和實驗證明，黃芪、葛根單用或配伍應用對糖尿病心血管并發癥有良好的療效，而且這些中藥也是臨床用于治療冠心病、心肌炎等心血管系統疾病的常用藥物。因此，為了探討糖尿病心肌病模型建立方法以及較全面地觀察其病理改變，同時闡明黃芪葛根湯的作用，我們建立了具有高血糖、高血脂和胰島素抵抗特征的2型糖尿病大鼠模型［2］。本研究主要從組織形態、超微結構、膠原纖維、細胞凋亡等多個角度觀察大鼠心肌病理改變及藥物的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級 SD雄性大鼠，體質量180～220g，購自廣東省醫學實驗動物中心(合格證號粵監證字2008A020)，飼養環境符合醫學實驗動物環境設施要求。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪葛根湯(HGD)浸膏每1g相當于生藥1.71g;鹽酸羅格列酮(Rsg)貴州圣濟堂制藥有限公司生產(批號20070502);鏈脲佐菌素(STZ)美國Sigma公司產品;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒德國羅氏公司產品。

1.1.3 主要儀器 日本NIKON E600顯微鏡，日本OLYMPUS BX51顯微鏡，日立H-600透射電鏡。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分組與給藥 大鼠先用高脂高熱量飼料(高脂飼料由基礎鼠料加酪蛋白、蔗糖、豬油等按比例組成，其中基礎鼠料52%，酪蛋白12%，蔗糖10%，豬油24%，磷酸氫鈣2%，復合多維0.1%，礦物質0.4%，鹽0.2%)喂養4周，然后以STZ 30mg/kg腹腔注射，1周后取血測空腹血糖(FBG)和糖耐量。選擇糖耐量異常(2hBG≥7.8mmol/L)的60只成模大鼠納入實驗。成模大鼠隨機分成5組(模型組、Rsg組、HGD高、中、低劑量組)，繼續以高脂飼料喂養8周。正常組10只大鼠一直采用基礎飼料喂養。各組按體質量分別灌胃給藥(10ml/kg)，每天1次，持續8周，正常組和模型組則給予等體積的蒸餾水。

1.2.2 標本采集與指標檢測 實驗結束當天經腹主動脈取血后處死各組動物，迅速開胸取出心臟，剪除包膜、血管，用冰生理鹽水洗凈，將小部分左心室切成1mm3小塊，3%戊二醛迅速固定，4℃保存待做電鏡標本;取部分心肌組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm切片，分別供 HE染色、Masson染色和TUNEL實驗用。

1.2.3 TUNEL檢測心肌細胞凋亡 切片脫蠟至水，PBS洗3遍，50μL/mL蛋白酶 K處理，37℃20min;PBS洗3遍，3%H2O2-甲醇，室溫封閉15min，PBS洗3遍，置4℃的0.1mol/L檸檬酸鈉(內含0.1%TritonX-100)8min;PBS洗3遍，加 TdT標記Bio-dUTP(TdT標記反應混合液)，37℃孵育60min。PBS洗3遍，加入Protection kit-POD，37℃避光孵育30min;PBS洗3遍，DAB顯色、水洗;蘇木素復染、水洗，脫水、透明、封片。心肌細胞核(圓形或橢圓形)位于心肌細胞中央，其中凋亡細胞核棕黃色，正常細胞核藍色。陰性對照細胞核全部藍色，陽性對照細胞核全部呈棕黃色。每個標本隨機選取10個高倍視野(×400)，用圖像分析軟件計數凋亡細胞核和正常細胞核，以凋亡細胞核與所有細胞核比值的平均值作為細胞凋亡指數。

1.2.4 統計學方法 應用SPSS 13.0統計學軟件進行分析處理，計量數據以均數±標準差(±s)表示。

2 結果

2.1 HE染色觀察心肌組織形態學

由圖1可見，糖尿病大鼠成模8周后，模型組心肌細胞排列紊亂、疏松，心肌細胞肥大且嚴重變性，甚至空泡變，細胞核固縮、裂解，間質炎性細胞、成纖維細胞增生，心肌間質有膠原纖維沉積。HGD高、中劑量組心肌細胞基本排列整齊，部分病變區有心肌細胞肥大、變性，心肌間質少見膠原纖維沉積;低劑量組心肌細胞排列紊亂，有的細胞核固縮、裂解;Rsg組心肌細胞排列有些紊亂，肌纖維腫脹，部分心肌細胞肥大、變性;正常組心肌組織結構正常，細胞排列整齊、致密。

2.2 Masson染色觀察心肌膠原纖維

正常組心肌細胞染成紅色，膠原纖維藍色，心肌膠原纖維分布均勻。圖2顯示，模型組心肌細胞間質、血管周圍可見膠原成分堆積，分布不均勻，排列紊亂，相互連接成網狀。各藥物組心肌膠原纖維分布較均勻，HGD低劑量組稍差，心肌細胞間質、血管周圍見少量膠原成分。采用Image ProPlus圖像分析系統進行心肌組織膠原相對含量測定(見圖3)，結果表明，與正常組比較模型組大鼠心肌組織膠原相對含量明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，HGD高、中、低劑量能不同程度減少心肌組織膠原相對含量(P＜0.01～P＜0.05)，提示該藥可以明顯抑制膠原纖維增生，Rsg組也能明顯減少膠原相對含量(P ＜0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織形態學改變(HE染色×100)Figure 1 Representative photomicrograph of myocardial tissue morphological changes，stained with hematoxylineosin( ×100).A:Control group，B:Diabetic model group，C:High-dose of HGD group，D:Middle-dose of HGD group，E:Low-dose of HGD group，F:Rosiglitazone group.

2.3 透射電鏡觀察心肌超微結構

正常組心肌細胞排列整齊，閏盤清晰、連續，結構完整。胞漿充滿大量縱向平行排列的肌原纖維，形成明暗相間的肌節結構。胞漿中有豐富的線粒體，結構完整，嵴密集、排列有序且充滿整個線粒體。模型組心肌細胞的肌原纖維排列紊亂、斷裂、分離、局部溶解，閏盤扭曲模糊斷裂，肌漿網擴張;核膜不完整并呈節段性溶解消失病變，異染色質凝聚;線粒體增多非常明顯且呈堆積狀，線粒體腫脹變性，嵴斷裂、溶解，線粒體基質溶解、消失，形成多個空泡區;心肌細胞可見糖原顆粒和脂滴沉著，還可見到髓樣小體。HGD高劑量組肌原纖維排列整齊，線粒體和細胞核形態正常，與正常組相似。中劑量組心肌超微結構也比較正常，低劑量組肌原纖維排列有紊亂現象，局部出現肌絲溶解、斷裂病變，但較模型組有所改善。Rsg組肌原纖維排列基本整齊，線粒體和細胞核形態基本正常，個別有畸形與腫脹病變，心肌細胞可明顯見到脂滴沉著(見圖4)。

圖2 各組大鼠心肌膠原纖維改變(Masson染色×200)Figure 2 Representative photomicrograph of myocardial collagen fibers change，stained with masson trichrome(×200)

圖3 各組大鼠心肌膠原相對含量比較Figure3 Collagen relative contents through image analysis of masson trichrome.Control:Control group，Model:Diabetic model group，HGD-H:High-dose of HGD group，HGD-M:Middle-dose of HGD group，HGD-L:Low-dose of HGD group，Rsg:Rosiglitazone group.▲▲ P ＜0.01 vs control; ＊＊ P ＜0.01，*P＜0.05 vs model(±s，n=10)

2.4 TUNEL實驗檢測心肌細胞凋亡

實驗結果顯示，糖尿病心肌病變模型組大鼠陽性細胞遠遠多于正常對照組(P＜0.01)，說明模型組心肌細胞存在凋亡增加現象。藥物干預后有不同程度凋亡細胞的表達，HGD高劑量、中劑量組、Rsg組的凋亡指數與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01)，HGD低劑量組的陽性表達高于其他藥物組(見圖5、圖6)。

3 討論

圖4 各組大鼠心肌超微結構改變Figure4 Myocardial ultrastructural changes in rats observed by transmission electron microscopy.

糖尿病心肌病變于1974年由Hamby等首先提出，其作為糖尿病的一種獨特的心臟并發癥目前已得到公認，其主要病理改變為心肌細胞肥大、凋亡、壞死，肌絲纖維大量丟失，心肌細胞外間質有不溶性膠原蛋白積聚和纖維化［3，4］，這種結構方面的病變將導致心肌收縮和舒張功能降低，易并發心力衰竭及心律失常。本病屬中醫消渴并發“心悸”、“胸痹”范疇，常以益氣養陰為基本治療原則。黃芪、葛根為中醫臨床常用藥對，二者對糖尿病、心血管疾病均有良好療效，許多中成藥玉泉丸、消渴丸、天芪降糖膠囊等都含有此藥對。黃芪葛根湯源自《證治匯補》，方中葛根甘涼生津止渴，升脾中清陽，輸津液以溉五臟而滋陰清熱。黃芪甘溫益氣健脾，取其氣復津還之意，二者相配益氣養陰、生津止渴，古今用于糖尿病及其并發癥的治療。

本研究采用HE染色觀察大鼠一般組織形態學改變，結果發現與正常組比較，模型組在組織形態學方面發生明顯的心肌病理改變，即心肌細胞排列紊亂、疏松，心肌細胞肥大、嚴重變性，成纖維細胞增生，心肌間質膠原纖維增生。而HGD各劑量組不同程度抑制這種心肌病變，尤其是高、中劑量心肌細胞基本排列整齊，僅部分病變區有心肌細胞肥大、變性，心肌間質少見膠原纖維沉積。進一步采用Masson三色染色并進行圖像分析，結果發現模型組心肌細胞間質膠原明顯增生且分布不均勻、排列紊亂，相互連接成網狀，而HGD能顯著減輕心肌纖維化病變。這個結果通過進一步的心肌羥脯氨酸含量測定得到證實［5］。

圖5 各組大鼠心肌細胞凋亡情況(TUNEL×400)Figure 5 Cardiomyocyte apoptosis defected by Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)method(×400)

圖6 各組大鼠心肌細胞凋亡指數比較Figure 6 Apoptotic index of cardiomyocyte defected by TUNEL method.▲▲ P ＜0.01 vs control; ＊＊ P＜0.01 vs model.(±s，n=10)

細胞學病變是糖尿病心肌病的一種重要病變。本研究觀察到，糖尿病模型組心肌細胞的肌原纖維排列紊亂并呈波浪狀改變，或斷裂、分離、局部溶解，閏盤扭曲模糊斷裂，肌漿網擴張。特別是線粒體增多非常明顯，呈堆積狀，線粒體腫脹變性，基質溶解、消失并形成多個空泡區，心肌細胞內見到髓樣小體。以上說明糖尿病大鼠心肌細胞明顯受到損傷，由于糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂出現“葡萄糖毒性”，導致心肌酶活性降低，有氧代謝不能順利進行，能量產生障礙，因此與能量代謝密切相關的線粒體病變較為明顯，表現在數量代償增多，發生腫脹、變性、嵴斷裂等改變。實驗結果還證實，HGD高、中劑量能明顯抑制這種心肌的超微結構改變，在肌原纖維、線粒體、細胞核等各個方面的表現都明顯優于模型組。

心肌細胞凋亡在各種心臟疾病的發病機制中都起著重要的作用［6，7］，過度的心肌細胞凋亡將導致心肌缺血、心力衰竭等病變。國內外眾多研究表明，糖尿病心肌病心肌細胞存在凋亡現象［8］，主要是因為高血糖時氧化應激增加，信號傳導路徑改變，導致基因表達異常，激活細胞程序化死亡，灶性壞死以及壞死區被纖維組織取代形成瘢痕，同時凋亡也可以導致細胞內活性氧增多，而心肌細胞間質纖維沉積及纖維化是糖尿病心肌病的另一重要因素。本研究利用TUNEL實驗測得糖尿病大鼠心肌細胞凋亡指數較正常對照組高，而HGD高、中劑量能顯著降低凋亡指數，提示該藥可以通過干擾心肌細胞凋亡程序而保護心肌，其機理有待于進一步的研究。

綜上所述，本研究建立的大鼠糖尿病心肌病變模型具有心肌細胞肥大、凋亡、壞死，心肌間質纖維化的典型心肌病病理特征，因此采用這種造模方法能復制與臨床發病機制接近的糖尿病心肌病變模型。黃芪葛根湯從宏觀的組織形態和微觀的超微結構都能明顯地防止或延緩糖尿病心肌病變的發生發展。羅格列酮是臨床常用的胰島素增敏劑，國內外也有文獻報道該藥可以用于治療糖尿病心血管并發癥的治療。我們的研究證實，該藥能顯著改善胰島素抵抗且具有一定的心肌保護作用，但在改善心肌病理形態學的長效作用方面可能略顯不足。

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