參附注射液對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠凋亡誘導因子表達的影響＊

徐 艷，王 軍

(徐州醫學院附屬醫院兒科，江蘇徐州 221002)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 新生7d齡SD大鼠，體質量12～18g，均由徐州醫學院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要儀器 8%O2/92%N2混合氣體(上海特種氣體廠);常壓缺氧艙(上海市兒科研究所);手動勻漿器;Western blot所用的儀器設備(徐州醫學院神經生物學實驗室提供);Eppendor臺式超速冷凍離心機(德國eppendo公司);－80℃超低溫冰箱(Thermo electron corporation);CK30倒置相差顯微鏡(日本Olympus);可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);PCR擴增儀(MJ Research，InC);Thermo酶標儀(上海熱電儀器有限公司);凝膠圖像分析處理系統(Labworks)(UVP Inc.Upland，CA，USA)。

1.1.3 主要試劑 胞核提取試劑盒(北京五洲元業生物有限公司);AIF一抗(Santa cruz公司)、兔抗羊二抗(北京中杉生物技術有限公司);NBT/BCIP顯色劑(碧云天生物公司);Marker(Santa cruz公司);AIF及β-actin引物合成、總RNA抽提試劑盒(Trizol法)、AMV一步法RT-PCR試劑盒(上海捷瑞生物技術有限公司);Tunel凋亡試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照 Rice法［1］制作HIBD模型和假手術模型。將新生7d齡SD大鼠用無水乙醚吸入麻醉(0.5～1.0min)后，取仰臥位，四肢固定于手術板上，頸正中線切開皮膚，游離右側頸總動脈絲線結扎，并縫合切口造成缺血。回窩休息2h。再置入一體積為2000ml、底部鋪有CO2吸收劑鈉石灰、與混合氣體相連的密閉有機玻璃箱內，該容器置于37℃水浴中。以1～2L/min的速度輸入含8%氧、92%氮氣的混合氣體，持續2h，造成缺氧。假手術組只做頸部切開和右頸總動脈分離術，不結扎，縫合切口后呼吸正常空氣。

1.2.2 分組及給藥方法 新生7d的SD大鼠隨機分為假手術組(S)、生理鹽水對照組(C)和參附治療組(SF)。生理鹽水對照組HI后立即腹腔注射生理鹽水10ml/kg，每日1次，連續注射3d;參附治療組HI后立即腹腔注射參附注射液，劑量及用法同生理鹽水對照組。每組按術后觀察時間點不同進一步分為 3h、6h、12h、24h、3d、7d 6 個亞組，每個亞組8只。

1.2.3 免疫印跡法檢測胞核中AIF蛋白表達的動態變化 (1)亞細胞器的分離:各組新生大鼠在各個時間點斷頭取腦，稱取患側大腦皮層新鮮腦組織100mg左右，參照胞核提取試劑盒(N1201)說明書步驟進行操作。將提取好的胞核貯存在－80℃冰箱中。采用改良的lowry法測胞核的蛋白濃度，牛血清白蛋白作為標準蛋白;(2)Western blot法測胞核中的AIF 制備10%分離膠和5%濃縮膠，每個上樣孔的上樣量均為50μg;電泳、半干轉將蛋白轉到NC膜上，脫脂奶粉封閉1h，將NC膜孵育在AIF(sc-9416，1∶300)，4℃過夜。將 NC 膜在兔抗羊二抗(1∶1000)中孵育2h，NBT/BCIP顯色，用 Image J軟件分析系統分析條帶光密度值(OD)。組蛋白H1(Histone-H1)作為內部參照，用每個樣本OD值與Histone-H1OD值的比值作為最后結果。

1.2.4 用RT-PCR法檢測腦皮層組織AIF mRNA的水平 各組新生大鼠在各個時間點斷頭取腦，稱取100 mg患側大腦皮層組織置入5ml無核酶的EP管中，放入－80℃冰箱中貯存備用;用Trizol法從組織中提取總的mRNA;一步法行RT-PCR，步驟參照說明書;2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統拍照并分析數據。AIF上游引物:5’-CGTCCC TTTCCTGCTGATTG-3’;下游引物:5’-TTCCATTCC ACTGTCTGAACTG-3’;目的基因長度:203bp，Tm:54.4℃;β-actin 上游引物:5’-CCATTGAACACG GGCATTG-3’;下游引物:5’-ACGACCAGAGGC ATACAG-3’;目的基因長度:252bp，Tm:55℃。

1.2.5 原位末端標記法(TUNEL)檢測腦皮層組織的凋亡細胞 按上述時間點，動物在乙醚麻醉下開胸，經心尖搏動處插管，用生理鹽水20 ml沖洗血流，繼之灌入4%多聚甲醛(0.1mol/L PB，pH 7.4)約20ml，灌畢即取右腦，沿視交叉前緣做2mm厚的冠狀切片，放入4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋后行6μm連續切片，進行Tunel染色，Tunel試劑盒(MK1022)購自武漢博士德公司，步驟參照說明書。光鏡下，胞核中有紫藍色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片以40×10倍光鏡下計數10個視野中的陽性細胞數，將10個視野計數的平均值作為統計參數。

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差(±s)表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，計量資料相關分析采用Pearson相關系數，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時間點各組新生大鼠AIF在胞核中的變化

表1圖1顯示，假手術組各時間點均沒有AIF表達;生理鹽水對照組在HI后3h即有少量的AIF表達，隨著HI時間的延長而增加，24h達到高峰，隨后開始下降，7d時仍有較高的表達;參附治療組在HI后3h、6h、12h與生理鹽水對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，24h開始下降，到7d時與生理鹽水對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

表1 胞核各組不同時間點AIF與Histone H1比值的比較(±s，n=8)

表1 胞核各組不同時間點AIF與Histone H1比值的比較(±s，n=8)

注:與S組比較:※P＜0.01，SF組與C組比較:△P＜0.01

3h 6h 12h 24h 3d 7d S 000000 0.143 0.112 0.063 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 C 0.335±0.019※ 0.723±0.005※ 1.058±0.010※ 1.238±0.040※ 0.882±0.016※ 0.627±0.015※SF 0.351±0.022※ 0.716±0.009※ 1.049±0.009※ 0.872±0.017※△ 0.635±0.017※△ 0.410±0.007※△t 1.553 1.696 2.016 23.752 30.389 36.636 P

2.2 各時間點腦皮層組織細胞中AIF mRNA的水平

表2圖2顯示，假手術組各時間點均有少量表達;生理鹽水對照組在HI后3h開始增加，24h達到高峰隨后下降，7d時仍高于假手術組(P＜0.05);參附治療組在HI后各時間點AIF mRNA的水平均低于生理鹽水對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 各組不同時間點AIF mRNA與β-actin mRNA比值的比較(±s，n=8)

表2 各組不同時間點AIF mRNA與β-actin mRNA比值的比較(±s，n=8)

注:與S組比較:※P＜0.01，SF組與C組比較:△P＜0.01

＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01±0.026 0.296±0.026 0.287±0.032 C 0.684±0.010※ 0.757±0.026※ 1.039±0.024※ 1.549±0.045※ 0.878±0.026※ 0.824±0.013※SF 0.450±0.022※△ 0.601±0.027※△ 0.917±0.039※△ 1.140±0.073※△ 0.607±0.017※△ 0.353±0.013※△F 484.137 443.835 1099.162 918.262 935.702 1108.996 P 3h 6h 12h 24h 3d 7d S 0.278±0.031 0.293±0.029 0.291±0.024 0.291

表3 各組各時間點凋亡陽性細胞數比較(個/HP)(±s，n=8)

表3 各組各時間點凋亡陽性細胞數比較(個/HP)(±s，n=8)

注:與S組比較:※P＜0.01，SF組與C組比較:△P＜0.01

＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01±1.2 C 5.5±1.0※ 14.5±2.6※ 37.7±1.9※ 60.7±2.2※ 25.2±2.1※ 6.7±1.8※SF 5.8±1.2※ 14.3±2.3※ 36.2±1.9※ 45.7±2.1※△ 11.2±1.7※△ 1.8±0.8△F 29.4 77.6 1207.5 1814.4 300.3 32.4 P 3h 6h 12h 24h 3d 7d S 1.5±1.0 1.3±1.0 1.3±0.8 1.2±0.8 1.3±1.0 1.2

圖1 各組不同時間點胞核內AIF的免疫印記條帶

圖2 各組不同時間點AIF mRNA電泳圖

2.3 各時間點腦皮層組織細胞的凋亡

表3顯示，光鏡形態學檢測各組各時間點均可見典型凋亡神經細胞，表現為染色質結緊、細胞皺縮，核固縮碎片，胞漿深染、胞漿空泡形成，見圓形凋亡小體。凋亡細胞周圍無炎癥反應，表現為單個細胞缺失。同時有細胞壞死，有較為清楚的壞死灶。S組各時間點腦皮質見個別的凋亡細胞;HIBD后C組和SF組3h凋亡細胞數開始增加，24h達到高峰后開始下降，7d時仍可見凋亡細胞多于S組(P＜0.01)。SF組腦細胞凋亡數在24h、3d、7d均低于C組 (P＜0.01)。

3 討論

參附注射液是由中醫治療厥脫證(休克)的著名古方參附湯加工提煉而成，為紅參和黑附片的提取物，主要成分為人參皂苷(Rb1)和烏頭類生物堿，具有益氣溫陽之功效。近年來研究發現，參附注射液具有多種藥理作用和神經保護作用，其機制為抑制細胞能量代謝障礙，清除氧自由基，減輕鈣超載，保護血管內皮細胞，減輕炎癥反應，抑制細胞凋亡等［2］。既往研究發現，參附注射液可以明顯降低細胞凋亡指數，降低細胞凋亡的基因，包括凋亡誘導基因如Bak、Bax、Fas和凋亡抑制基因如 Bcl-2、Bcl-XL等的表達，有效防止細胞凋亡的末端效應Caspase的激活，從而能明顯抑制細胞凋亡［3～7］。但參附注射液是否對AIF具有抑制作用，國內外未見相關報道。

凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)是一種57kDa的黃素蛋白，存在于線粒體內外膜間，具有維持線粒體結構和促凋亡作用。一旦細胞遇到凋亡刺激，AIF從線粒體釋放轉入細胞漿或核內，引起染色質的凝聚和DNA的斷裂。Zhu C等［8］研究AIF基因變異鼠缺氧缺血后腦梗死面積與野生鼠比較，雄鼠下降53%，雌鼠下降43%。Culmsee C等［9］發現，AIF缺乏對未成熟大鼠腦缺血后的保護作用超過50%，遠遠高于對成年大鼠腦缺血的保護作用。

李峰等［10］通過用不同劑量的參附注射液腹腔注入SD大鼠，用以研究其對顱腦損傷的保護作用。結果發現，不同劑量間無劑量效應關系，故本實驗選擇中等劑量的參附注射液(10ml/kg)。本研究顯示，假手術組僅有少量的AIFmRNA表達;生理鹽水對照組在HI后3h AIF mRNA表達開始增加，24h達到高峰隨后下降，提示在腦缺氧缺血這種凋亡信號刺激下，AIF的轉錄開始活躍，且AIF mRNA隨時間的動態變化與HI后神經細胞凋亡發生規律吻合，提示AIF基因轉錄參與細胞的凋亡，這與張麗等［11］研究局灶性大鼠腦缺血再灌注損傷AIFmRNA表達變化的結果相似。參附治療組在HI后每一時間點AIFmRNA表達均明顯低于對照組，提示參附注射液能夠在轉錄水平上抑制AIF的表達，從而抑制凋亡起到腦保護作用。

本研究發現，假手術組胞核內沒有AIF的表達，提示正常情況下胞核內沒有或有極少量的AIF表達;生理鹽水對照組在HI后3h AIF核轉位開始增加，24h達到高峰隨后下降。這與腦皮層凋亡細胞數的變化趨勢一致，提示AIF核轉位參與了細胞的凋亡。華正宇等［12］用免疫組化方法研究局灶性大鼠腦缺血再灌注損傷AIF的表達，也得出與本研究相似的結果。在HIBD后3h、6h、12h胞核中的AIF表達較對照組差異無統計學意義，24h、3d、7d胞核中的AIF表達較對照組明顯減少。我們同時也發現，參附治療組凋亡細胞數在24h后也明顯少于對照組，提示參附注射液可以通過抑制AIF核轉位來抑制凋亡。參附注射液對蛋白和基因抑制作用的時間點不同，考慮可能與參附注射液透過血腦屏障需要一定的時間才能發揮藥理作用有關。

總之，通過本研究進一步闡明了參附注射液抑制缺氧缺血性腦損傷新生大鼠凋亡的機制，參附注射液不僅可以抑制轉錄水平的AIF，而且也可以抑制AIF的核轉位，從而抑制凋亡的發生，發揮腦損傷的保護作用，為參附注射液在新生兒缺氧缺血性腦病的臨床應用提供了更堅實的理論基礎。

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