獨一味對大鼠佐劑性關節炎防治作用的實驗研究

王麗娟，王 勇，楊 婕，儲燕平，張書靖

(1.天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134;2.天津商業大學生物技術與食品科學學院制藥系，天津 300134)

獨一味 Lamiophloms rotate(Benth.)Kudo為唇形科無莖多年生草本植物，以根及根狀莖入藥，是藏、蒙、納西等民族民間常用草藥。研究表明，獨一味具有止血鎮痛、抗菌、改善學習記憶功能以及預防胃潰瘍發生等諸多方面的作用，臨床主要用于骨外傷、術后及婦科等多種疾病的鎮痛、止血、消炎等［1～6］。文獻報道，獨一味巴布膏對免疫功能有調節作用［7］，但其對免疫性關節炎的影響至今未見報道。佐劑誘導的大鼠關節炎(adjuvant-induced arthritis，AIA)是一種免疫性炎癥模型，是研究治療風濕和類風濕關節炎藥物的理想病理模型，常用于篩選抗炎免疫藥物。本實驗觀察了獨一味對完全弗氏佐劑誘導的大鼠類風濕關節炎的防治作用，為獨一味臨床用途的進一步開發提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑

獨一味購自青海西寧，實驗室提取并配制成所需濃度;醋酸潑尼松片，天津力生制藥股份有限公司(批號1006044)，研細用生理鹽水配制成混懸液備用;完全弗氏佐劑10ml，美國Sigma公司。

1.2 動物

Wistar大鼠14～16周齡，體質量160g～210g，雌雄兼用，由天津市實驗動物中心提供(合格證號為SCXK(津)2010-0002)。

1.3 主要儀器

PV-200足跖容積儀，成都泰盟科技有限公司;UV-7504單束光紫外-可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司;HZS-H水浴振蕩器，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司。

2 方法

2.1 獨一味水提取物的制備

獨一味粉碎并干燥，稱量后加水浸泡并煎煮3次，每次1 h，第1次加水量為11倍，第2、3次加水量為8倍，合并煎液室溫下冷卻、過濾，將濾液濃縮至生藥 1g·ml－1，置于冰箱中備用。

2.2 獨一味醇提取物的制備

獨一味粉碎并干燥，稱取適量并加入20倍量60%乙醇，回流提取25min，室溫下冷卻、過濾，將濾液濃縮至生藥1g·ml－1，置于冰箱中備用。

2.3 預防性給藥觀察獨一味對關節炎原發病變的影響

Wistar大鼠50只，體質量160g～210g，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只。即1組:生理鹽水;2組:模型;3組:醋酸潑尼松(0.5g·kg－1);4組:獨一味水提取物(生藥1.0g·kg－1);5組，獨一味醇提取物(1.0g生藥·kg－1)。各組均灌胃給藥，容量為10ml·kg－1，1 組和2 組灌胃等容量生理鹽水，每日 1次，連續22d。于給藥第4天制作免疫性炎癥模型。每鼠右足跖消毒后，皮下注射完全弗氏佐劑0.1ml進行致炎，1組注射等容量生理鹽水。在致炎前、致炎后第18、42、66、8天和第19天分別測各鼠右足容積，通過比較大鼠致炎側足容積的變化，評價獨一味對佐劑性關節炎原發病變的影響［8］。

2.4 預防性給藥觀察獨一味對繼發病變影響

Wistar大鼠50只，體質量160g～210g，雌雄各半，隨機分成5組，每組10只(分組情況同2.3)。由于遲發型超敏反應所致的繼發性病變一般出現于致炎后10d左右，故各鼠右足跖消毒后皮下注射完全弗氏佐劑0.1ml進行致炎，1組注射等容量生理鹽水。于致炎后第6天各組灌胃給藥，容量為10 ml·kg－1，1組和2組灌胃等容量生理鹽水，每日1次，連續14 d。于致炎前、致炎后第11～14天和第19天分別測各鼠左足(致炎對側)容積。致炎19d后，采用關節炎綜合評分法對關節炎的嚴重程度進行評價［9］。四肢及足關節評分標準:0分=正常，1分=僅皮膚紅，2分=皮膚紅+輕腫，3分=嚴重腫，4分=關節變形、強直。每只鼠的關節炎總分數為四足分數之和。通過比較各組大鼠左足容積和關節炎綜合評分，評價獨一味的抗風濕作用。

2.5 治療性給藥觀察獨一味對繼發病變的作用

Wistar大鼠體質量160g～210g，雌雄各半，隨機分成5組，每組8只(分組情況同2.3)。各鼠右足跖消毒后皮下注射完全弗氏佐劑0.1ml進行致炎，1組注射等容量生理鹽水。于致炎后第19天(繼發病變已經形成)各組灌胃給藥，容量為10 ml·kg－1，1組和2組灌胃等容量生理鹽水，每日1次，連續7 d。于致炎前、致炎后第11、14、19、22、25 天和第 30 天分別測各鼠左足(致炎對側)容積。通過比較各組大鼠左足容積，評價獨一味對免疫性炎癥的治療作用［8］，同時對體質量增長、胸腺指數、脾指數進行比較。

2.6 獨一味對大鼠炎癥組織前列腺素(PGE2)含量的影響

取健康合格大鼠30只，隨機分為5組，每組6只(分組情況同2.3)。各組灌胃給藥，1組和2組給予等容量生理鹽水，連續給藥7d。于末次給藥后1h，各鼠分別右后足足跖皮下注射1%角叉菜膠0.1ml，1組注射等容量生理鹽水。5h后處死大鼠，剪取右足(致炎側)稱其質量，沿中線縱向剖開，置于5ml生理鹽水中4℃浸泡過夜，離心浸泡液，取上清 0.15ml，加入 0.5mol·L－1氫氧化鉀-甲醇溶液1ml，置于50℃恒溫水浴中異構化20min，加甲醇4ml。在278nm波長下測定光密度，以每克炎性組織中相應的光密度值表示PGE2含量［10］。

2.7 統計學方法

3 結果與分析

3.1 獨一味對原發病變的預防作用

表1顯示，模型組大鼠致炎后右足腫脹逐漸明顯，42h腫脹達高峰，66h減輕，8d再度腫脹，之后腫脹減輕。與生理鹽水組比較，模型組大鼠右足(致炎側，原發病變)容積差異有統計學意義。與模型組比較，獨一味和潑尼松組大鼠右足腫脹明顯減輕(P＜0.05)，對原發病變具有顯著的消腫和抗炎作用。

表1 獨一味對大鼠佐劑性關節炎原發病變的預防作用(±s，n=10)

表1 獨一味對大鼠佐劑性關節炎原發病變的預防作用(±s，n=10)

注:與生理鹽水組比較:▲▲P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 致炎前右足容積/ml致炎后右足容積/ml 18h 42h 66h 8d 19d生 理 鹽 水 0.70±0.07 0.70±0.07 0.71±0.05 0.73±0.05 0.76±0.04 0.82±0.04模0.93±0.07 0.93±0.07 0.88±0.06型 0.71±0.06 1.06±0.08▲▲ 1.10±0.09▲▲ 0.96±0.09▲▲ 0.98±0.07▲▲ 0.94±0.07▲▲醋 酸 潑 尼 松 0.70±0.08 0.86±0.15＊＊ 0.97±0.07＊＊ 0.88±0.08* 0.91±0.08* 0.85±0.07*獨 一味水提取物 0.71±0.05 0.80±0.13＊＊ 0.96±0.04＊＊ 0.88±0.07* 0.90±0.06* 0.86±0.07*獨一味醇提取物 0.72±0.07 0.90±0.14＊＊ 0.99±0.06＊＊

3.2 獨一味對繼發病變的預防作用

獨一味對大鼠致炎后不同時間左足容積的影響。表2顯示，致炎10d后，模型組大鼠致炎對側足也發生了腫脹，并隨時間逐漸加重。致炎后19d腫脹明顯，與生理鹽水組比較，模型組大鼠的足容積差異有統計學意義。獨一味組和潑尼松組大鼠的左足容積較模型組明顯減小，表明腫脹減輕，且關節炎綜合評分與模型組比較差異有統計學意義，說明獨一味對該繼發病變有明顯的抑制作用。

3.3 獨一味對繼發病變的治療作用

表3顯示，獨一味對大鼠致炎后不同時間致炎對側足(左足，繼發病變)容積的影響;表4顯示，獨一味對大鼠體質量及胸腺指數、腎上腺指數的影響。

表3顯示，在繼發病變發生后，左足腫脹逐漸加重。至第19天與生理鹽水組比較，各組腫脹明顯(足容積差異有統計學意義)，隨時間推移腫脹持續。而經藥物治療后的大鼠足腫脹明顯減輕，與模型組比較獨一味組和潑尼松組大鼠的足容積差異有統計學意義(P＜0.05)，表明獨一味和潑尼松對免疫性炎癥有一定的治療作用。表4顯示，模型組大鼠的體質量增長較緩慢，但與生理鹽水組比較差異無統計學意義，各組的胸腺指數和腎上腺指數比較差異無統計學意義。

表2 獨一味對大鼠佐劑性關節炎繼發病變的預防作用(±s，n=10)

表2 獨一味對大鼠佐劑性關節炎繼發病變的預防作用(±s，n=10)

注:與生理鹽水組比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組別 致炎前左足容積/ml致炎后左足容積/ml 關節炎綜合評分生 理 鹽 水 0.70±0.08 0.77±0.09 0.78±0.06 0.80±0.08 0.8 11d 12d 13d 14d 19d 1±0.07 0.83±0.05 0模型 0.69±0.05 0.83±0.07 0.86±0.05▲▲ 0.88±0.05▲ 0.90±0.07▲ 0.93±0.05▲▲ 10.5±1.8▲▲醋 酸 潑 尼 松 0.71±0.06 0.79±0.06 0.80±0.06* 0.82±0.06 0.84±0.05* 0.86±0.06* 6.1±1.2＊＊獨 一 味 水 提 物 0.71±0.05 0.77±0.08 0.81±0.06 0.83±0.06 0.83±0.06* 0.84±0.07* 6.7±1.3＊＊獨 一 味 醇 提 物 0.70±0.06 0.79±0.07 0.82±0.08 0.85±0.07 0.85±0.07 0.87±0.06* 6.3±1.5＊＊

表3 獨一味對大鼠佐劑性關節炎繼發病變的治療作用(±s，n=8)

表3 獨一味對大鼠佐劑性關節炎繼發病變的治療作用(±s，n=8)

注:與生理鹽水組比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

組別 致炎前左足容積/ml致炎后左足容積25d 30d生 理 鹽 水 0.69±0.06 0.76±0.06 0.77±0.06 0.78±0.06 0.8/ml 11d 14d 19d(開始給藥)0±0.08 0.82±0.07模型 0.70±0.06 0.81±0.06 0.86±0.06▲▲ 0.92±0.07▲▲ 0.95±0.08▲▲ 0.98±0.07▲▲醋 酸 潑 尼 松 0.71±0.07 0.81±0.08 0.87±0.09▲ 0.93±0.11▲▲ 0.84±0.10* 0.84±0.10＊＊獨 一 味 水 提 物 0.71±0.06 0.80±0.08 0.86±0.09▲ 0.92±0.09▲▲ 0.84±0.08* 0.85±0.09＊＊獨 一 味 醇 提 物 0.71±0.07 0.80±0.08 0.87±0.08▲ 0.92±0.09▲▲ 0.85±0.08* 0.84±0.08＊＊

表4 獨一味提取物對佐劑性關節炎大鼠體質量增長及臟器指數的影響(±s，n=8)

表4 獨一味提取物對佐劑性關節炎大鼠體質量增長及臟器指數的影響(±s，n=8)

注:各組比較:均P＞0.05

組別 實驗前體質量/g 致炎后19d體質量/g 體質量增長/% 胸腺指數/(mg·100g－1)腎上腺指數/(mg·100g－1)生 理 鹽 水 178.5±17.3 210.4±20.7 17.9 128.92±29.67 19.92±2.29 95±4.72模型 178.5±17.0 200.6±18.0 12.4 130.26±23.84 21.01±4.94醋 酸 潑 尼 松 178.8±16.6 204.7±16.3 14.4 134.48±32.21 20.90±5.44獨一味水提取物 179.0±17.6 208.2±19.7 16.3 128.54±16.97 20.59±4.63獨一味醇提取物 178.6±16.6 207.6±18.6 16.2 125.11±25.83 18.

3.4 獨一味對炎癥組織PGE2含量的影響

表5顯示，模型組大鼠炎癥組織內的PGE2含量明顯增加，而潑尼松和獨一味組炎癥組織的PGE2含量雖較生理鹽水組增加，但明顯低于模型組，表明潑尼松和獨一味的抗炎作用與抑制炎性組織PGE2的釋放有關。

表5 獨一味對炎癥組織PGE2含量的影響(±s，n=6)

表5 獨一味對炎癥組織PGE2含量的影響(±s，n=6)

注:與生理鹽水組比較:▲0.01＜P＜0.05，▲▲P＜0.01;與模型組比較:＊＊ P ＜0.01

組別PGE2含量/光密度·每克炎癥組織－1生 理 鹽 水 組0.025±0.007模 型 組 0.054±0.006▲▲醋 酸 潑 尼 松 組 0.038±0.008▲＊＊獨 一 味 水 提 取 物 組 0.038±0.006▲＊＊獨 一 味 醇 提 取 物 組 0.033±0.008＊＊

4 討論

大鼠佐劑性關節炎是一種免疫性炎癥模型，其發病機制和病理表現與人類風濕關節炎相似，是評價防治類風濕關節炎的常用藥物模型之一［11～13］。佐劑性關節炎分原發性反應期和繼發性反應期，原發性病變表現為致炎局部的炎癥反應，繼發性病變一般出現于致炎后10d左右，主要表現為多發性關節炎［8］。

該實驗中，模型組大鼠足部(右足)皮下注射完全弗氏佐劑后，致炎側足逐漸腫脹(原發病變)，18h腫脹達高峰，3d減輕，8d再度腫脹，表現為急性炎癥反應;注射對側足(左足)的病變(繼發病變)發生于10d后，表現為足部發紅、腫脹并逐漸加重，個別鼠足部變形，皮膚表面出現潰瘍;在致病后，大鼠精神萎靡、毛發失去光澤、多發關節腫脹并伴有活動障礙，體質量增長緩慢，與文獻報道相似［8，14］。

潑尼松為腎上腺皮質激素類藥物，具有抗炎和免疫抑制作用，臨床可用于治療風濕和類風濕關節炎。實驗中觀察到，潑尼松使大鼠佐劑性關節炎原發病變和繼發病變均有較明顯的減輕，臨床表現癥狀緩解，與其非特異性抗炎及免疫抑制作用有關。獨一味能抑制大鼠原發病變的足腫脹，減輕炎癥反應，與以往的實驗結果一致［2］。獨一味預防給藥對繼發病變的形成也有較明顯的抑制作用，致炎19d后測得的足容積及炎癥綜合評分均與模型組差異有統計學意義，與潑尼松的效果相近;獨一味治療性給藥(致炎后第19天給藥)，于致炎后第25天和第30天測得的足容積與模型組比較差異有統計學意義，說明獨一味對繼發病變有明顯治療效果。獨一味對急性炎癥和佐劑引起的遲發型超敏反應均有較好的抑制作用，這與獨一味膠囊劑、片劑的臨床治療效果相吻合［15～17］，實驗結果為獨一味臨床用于治療風濕和類風濕關節炎提供了理論支撐。

有證據表明，PGE2參與關節炎病變的發生發展。用抗PGE2單克隆抗體中和PGE2能減輕佐劑性關節炎大鼠的足腫脹和痛覺過敏，也能減少IL-6等炎性因子的分泌［18］。非甾體抗炎藥布洛芬能顯著抑制大鼠佐劑性關節炎炎性組織PGE2的分泌，使關節腫脹減輕，關節疼痛減輕［13］。本實驗用角叉菜膠致大鼠足急性炎癥，炎性組織中PGE2的含量明顯增加。獨一味2種提取物均能使大鼠致炎的局部組織中PGE2的含量較模型組顯著減少，與模型組間比較差異有統計學意義，表明獨一味能抑制炎性組織PGE2的合成(或釋放)，其對類風濕關節炎的作用機制可能與非甾體抗炎藥的作用機制有相似之處，即抑制炎性組織PGE2的合成或釋放。獨一味的主要化學成分有黃酮、環烯醚萜類和苷類，其抗炎作用可能與其所含黃酮成分有關［19］。而獨一味對佐劑性關節炎的作用與哪類化學成分有關，以及其對佐劑性關節炎的確切作用機制還有待進一步的研究。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:化學工業出版社，2005:185.

［2］王麗娟，王慶妍，可妍，等.獨一味水提取物與醇提取物鎮痛抗炎作用的比較研究［J］.時珍國醫國藥.2011，22(8):2037-2038.

［3］王麗娟，王亞麗，李蓓，等.獨一味對小鼠學習記憶能力的影響［J］.時珍國醫國藥，2009，20(7):1761-1762.

［4］王麗娟，彭勍，王勇，等.獨一味對實驗性小鼠胃潰瘍的影響［J］.時珍國醫國藥，2009，20(5):1189-1190.

［5］裴計榮.獨一味膠囊治療細菌性陰道病療效觀察［J］.臨床合理用藥，2010，3(9):76-77.

［6］王芳，周綿莉，朱崇云.獨一味膠囊治療月經過多臨床研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2008，15(1):59-60.

［7］楊漾，何夢婕，蕭海容，等.獨一味巴布膏鎮痛、免疫作用的實驗研究［J］.中藥藥理與臨床，2011，27(4):60-62.

［8］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學實驗方法學［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2003:920.

［9］戴敏，魏偉，汪倪萍，等.木瓜苷對大鼠佐劑性關節炎的治療作用［J］.中國藥理學通報，2003，19(3):340-344.

［10］陳奇.中藥藥理學研究方法學［M］.2版.北京:人民衛生出版社，2006:362.

［11］李振彬，杜志峰，楊志霞，等.通心絡膠囊對佐劑性關節炎的影響及其作用機制探討［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2007，13(6):428-429.

［12］Jacobson PB，Borgan SJ，Wilcox，et al.A new spin on an old model:In vivo evaluation of disease progression by magnetic resonance imaging with respect to standard inflammatory and parameters and histopathology in the adjuvant arthritis rat［J］.Arthritis Rheum，1999，42(10):2060.

［13］盧毓雄，于曄，王玨，等.益腎蠲痹丸與布洛芬合用治療佐劑性關節炎模型大鼠的實驗研究［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2006，12(7):513-514.

［14］胡福良，朱威，陳民利，等.工蜂蛹及其提取物對慢性炎癥和免疫性炎癥的作用及機理［J］.浙江大學學報(農業與生命科學版)，2005，31(5):587-592.

［15］謝海連.獨一味膠囊治療風濕性關節炎28例［J］.中國中醫藥信息雜志，2000，7(10):36-37.

［16］王鋼.獨一味片治療風濕性關節炎72例［J］.中國中醫藥信息雜志，2001，8(9):72.

［17］葉飛，楊洪彬，徐永旭.獨一味膠囊治療類風濕性關節炎69例的臨床研究［J］.世界中醫藥，2007，2(6):339-340.

［18］JP Portanova，Y Zhang，GD Anderson，etal. Selective neutralization of prostaglandin E2blocks inflammation hyperalgesia and interleukin 6 production in vivo［J］.J Exp Med，1996，184:883-891.

［19］張毅，王旭光.木犀草素的體外抗炎機制研究［J］.廣州中醫藥大學學報，2007，24(3):231-233.