補腎健脾方對去卵巢大鼠骨質疏松癥細胞因子水平的影響

王明樂

(河南科技大學第一附屬醫院，洛陽 471003)

骨質疏松癥(ostoeporosis，簡稱OP)是以骨量減少、骨組織微細結構退行性改變為特征，骨脆性增加，易發生骨折的一種全身代謝性骨病。目前對骨質疏松癥的西藥治療主要有骨吸收抑制劑和骨形成促進劑，雖然治療藥物較多，但有確切療效的很少見。本研究通過去卵巢大鼠骨質疏松模型，研究補腎健脾方對血清 IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1等細胞因子水平的影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

補腎健脾方由河南科技大學天然藥物化學教研室提供，每1g含生藥2g，用蒸餾水將藥物配成每毫升含生藥 0.5g混懸液，置4℃冰箱備用(批號20081102)，購自北京四環制藥二廠，取一類藥片5mg，充分研細，用時用蒸餾水稀釋至所需濃度。大鼠給藥量按文獻方法折算［1］。大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1ELISA測定試劑盒購自上海名典生物工程公司，為美國R＆D分裝試劑。

1.2 動物

60只雌性6月齡清潔級SD大鼠，體質量270±10g，由河南省實驗動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養及手術操作 將60只大鼠進行1周適應性飼養，將大鼠隨機分為假手術組(Sham)(n=15)和去卵巢組(OVX)(n=45)。

手術過程:先將大鼠采用30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉，取俯臥位于手術面板上。剪去大鼠背部中下部分被毛，碘伏消毒，在無菌條件下在背部中央做約1cm縱行切口，向兩側分離皮膚，在左右兩側腹后壁肌肉層較薄弱處打開腹腔，視野中可見乳白色發亮的脂肪團，卵巢即包埋其中。用無齒鑷夾住脂肪團輕輕提出切口外，分離脂肪團，可見粉紅色卵巢，用小號止血鉗在子宮末端與卵巢之間的最細處夾閉，手術縫合線接扎后，用眼科剪將卵巢全部切除，松開止血鉗將子宮輕輕還入腹腔，分別縫合肌肉層和皮膚對皮后，酒精棉球清理手術切口。Sham組大鼠在將卵巢提出體外后，僅切除部分卵巢周圍的脂肪組織，其他操作同OVX組。

按每籠5只分籠飼養。各組間大鼠體質量差異無統計學意義，每日觀察活動、飲食等一般狀況，每月稱量體質量1次。采用顆粒飼料按照Sham組大鼠攝食量喂養，自由飲水，室溫保持22℃，相對濕度60%，每日光照12h(8am～8pm)。

1.3.2 分組及給藥 大鼠全部蘇醒后，將OVX組大鼠隨機分為3組，即陽性對照、補腎健脾方組和去卵巢模型組，每組15只。

術后1周開始給藥，陽性對照組，口服灌胃給予尼爾雌醇，每2周1次，0.21mg/kg體質量，每次2ml;補腎健脾方組口服灌胃給予補腎健脾方，生藥含量為0.5g/ml，每次2ml，每天1次;假手術組和去卵巢組給予同劑量的自來水。

1.3.3 檢測指標及方法 實驗過程中，所有大鼠自由飲水攝食，每月稱量1次體質量，大鼠處死前稱量體質量。大鼠處死后取出子宮，稱量子宮質量，并記算子宮指數，子宮指數=子宮濕重(g)/體質量(kg)。實驗結束前，禁食1d，自由飲水，將全部大鼠股動脈放血處死，將全血轉移至標記的離心管中，4℃靜置30min后，以2000g在4℃離心20min，分離血清用于血清細胞因子ELISA檢測。

1.4 統計學方法

采用 SPSS13.0統計軟件分析，實驗結果以均數±標準差(±s)表示，各組間進行單因素方差分析(ANOVA)，各組間兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 補腎健脾方對去卵巢大鼠體質量及子宮重量的影響

表1顯示，實驗開始時各組動物體質量之間未見有差別。隨著時間變化，各組大鼠體質量逐漸增加，均呈增長趨勢，但其增長在各組間比較差異無統計學意義。與假手術組比較，去卵巢組大鼠的子宮重量及子宮系數均明顯降低(P＜0.01)，經尼爾雌醇和補腎健脾方治療后子宮重量及子宮系數顯著增高(P＜0.01)。

表1 補腎健脾方對去卵巢大鼠體質量及子宮濕重的影響

2.2 補腎健脾方對去卵巢大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1 的影響

與假手術組比較，去卵巢組大鼠IL-6和TNF-a水平顯著升高，IL-4和IGF-1水平顯著降低(P＜0.01)，尼爾雌醇和補腎健脾方治療后，能降低IL-6和TNF-a水平，提高IL-4和IGF-1水平，差異有統計學意義(P＜0.05)。

表2 補腎健脾方對去卵巢大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1的影響

3 討論

骨質疏松癥是一種多病因的增齡性病變，隨著老齡化社會的到來越來越受到人們的重視。目前認為本病主要與年齡、內分泌紊亂、鈣吸收不良以、免疫、遺傳、營養與生活方式等因素有關，主要臨床表現為胸背部和下腰部疼痛、畸形及骨折。骨質疏松大鼠模型的制作方法主要有維甲酸、去卵巢和糖皮質激素造模3種，采用雌性大鼠雙側卵巢切除方法進行造模，是研究絕經后骨質疏松癥(PMO)的經典模型［2］。現代醫學研究認為，PMO是一種由于女性絕經后體內雌激素水平下降導致的骨質疏松癥，因此雌激素替代療法(ERT)是當前防治絕經后骨質疏松的首選方法，然而長期使用雌激素會增加乳腺癌、腦卒中、心肌梗死、膽囊炎以及血栓形成等發病風險。

中醫學上把骨質疏松癥歸屬為“虛勞”、“骨痹”、“骨痿”范疇。根據中醫“腎主骨”理論，腎精不足、腎氣虛衰是導致原發性骨質疏松的重要原因，用來治療骨質疏松癥的中醫藥組方多從補腎著手，補腎藥物可通過補腎益脾達到補骨的作用。近年來，在臨床和基礎實驗中證實很多富含植物雌激素的單味中藥如淫羊藿、大豆、骨碎補等及其提取物、中藥復方具有明顯的抗骨質疏松作用［3～9］。

在骨代謝過程中，成骨細胞不斷形成新骨，破骨細胞不斷吸收舊骨，骨組織的形成和吸收達到一種動態的平衡，因此血清生化指標能反映骨組織的變化。TNF-a是由單核巨噬細胞產生的的一種細胞因子，主要作用于破骨細胞，使破骨細胞活性增強，是一種骨吸收促進劑，能抑制骨形成。IL-6是由激活的淋巴細胞、單核巨噬細胞、骨髓細胞合成和分泌，它是破骨細胞主要的調節因子之一，能夠刺激破骨細胞的增殖和功能表達。IL-4也是影響破骨細胞的1個細胞因子，能與其他細胞因子、激素協同作用，共同調節破骨細胞形成及骨吸收。IL-4是一種骨吸收抑制劑，可以抑制破骨細胞及其前體。類胰島素樣生長因子(IGF)由成骨細胞合成，是骨骼中最豐富的生長因子。IGF-1可促進細胞增殖與分化，抑制凋亡，是促進骨形成的重要因素［10］。

本研究結果表明，去卵巢后大鼠體質量增加，子宮質量減輕，IL-6和TNF-a水平顯著升高，IL-4和IGF-1水平顯著降低，說明造模成功。用藥組與模型組比較，均降低了IL-6和TNF-a水平，提高了IL-4和IGF-1水平，說明補腎健脾方極可能通過IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1等細胞因子起到治療骨質疏松的作用。

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