藻細胞計數及死/活分析的流式細胞儀方法*

陳慧婷，陶 益，朱 佳

（1.深圳市環境工程科學技術中心，廣東 深圳 518055；2.清華大學深圳研究生院 環境工程與管理研究中心，廣東 深圳 518055；3.深圳職業技術學院 建筑與環境工程學院，廣東 深圳 518055）

0 前 言

我國許多地區水源地水體富營養化加劇，原水中藻類含量升高，影響水廠生產及水質安全．大量聚集的藻細胞會堵塞并腐蝕源水管道、增加混凝劑投加量、堵塞濾池、增加反沖洗負荷、提高消毒成本，影響水廠工藝運行[1]．凈水過程可能引起藻細胞大量破裂，細胞內藻毒素、嗅味物質、及藻類有機物（AOM，消毒副產物的重要前體物）等有害藻源有機污染物釋放進入水中[2]，但難以被常規工藝去除，形成水質安全風險，甚至造成大規模供水危機．

藻類計數和藻細胞死活分析是水廠藻類分析工作中的兩項難題．傳統藻類計數采用顯微鏡計數，水樣需經過固定、沉淀、濃縮、顯微鏡觀察等步驟，工作量大，耗時較長（>48 h），影響檢測時效性[3]．目前，對于凈水過程引起藻細胞破裂死亡，從而加劇藻毒素等胞內物質釋放風險的問題尚缺乏有效研究手段．對于我國原水中廣泛存在的銅綠微囊藻等藍藻，因其細胞較小，難以通過顯微鏡觀察藻細胞死活狀態．因此，在我國許多地區采用高藻原水的背景下，隨著飲用水質量標準的不斷提高，凈水處理中藻細胞數及細胞死活狀態的分析將得到更多關注．

流式細胞技術是在顯微鏡技術和血球計數儀器基礎上發展起來的一種在液體流動狀態下觀測細胞技術，具有快速、準確、自動化程度高的特點．近年來流式細胞技術主要被用于藻類生理生態學研究領域，在藻類細胞周期[4]、藻類種群競爭[5]、產毒藻類熒光原位雜交檢測[6]等研究中發揮了重要作用．

本研究以我國典型藍藻銅綠微囊藻和綠藻橢圓小球藻為例，建立了藻細胞數及細胞死活狀態的流式細胞分析方法，以紫外消毒處理為例，應用流式細胞術檢測了處理前后藻細胞數及細胞死活狀態．

1 材料方法

1.1 藻種的購置及培養

實驗采用典型淡水藻類銅綠微囊藻（M.aeruginosa 905）和橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea，FACHB 40），藻種由中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB）提供．采用BG-11培養基培養，光照培養箱中溫度保持在（25±1）°C，光暗周期設置為12 h:12 h，光照強度為2000 lx．

1.2 藻細胞計數

1）顯微計數藻細胞數：取流式細胞術實驗相同的樣品，采用血球計數板法進行藻細胞計數，于共聚焦激光掃描顯微鏡（LSM 510，Carl Zeiss，德國）熒光視野下計數藻細胞數．

2）流式細胞術計數藻細胞數：本研究中采用雙組分絕對計數微球（Caltag Laboratories公司，美國）進行藻細胞計數．該計數微球試劑中包含A、B2種微球，其可以通過流式細胞儀的FL3通道加以區分．計數樣品是，加入20 μL計數微球加入 1 mL藻液中，混勻 30 s，用流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）檢測，激發波長為488 nm．由FL3通道收集計數微球熒光，如圖1所示．藻細胞數計算公式為：

1.3 藻細胞死活狀態檢測

實驗選取正常培養的銅綠微囊藻和橢圓小球藻細胞，100 °C熱處理10 min．分別將兩種經過熱處理后的死亡藻細胞與各自正常培養的藻細胞按比例配比，其中混合液中熱處理死亡細胞最終比例設置為0%，25%，50%，75%，100%．每個樣品均設置3個重復．

本研究中藻細胞死/活狀態檢測采用 SYBR greenⅠ（SYBR）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色的方法（Gregori et al., 2001）．其中，染料SYBR能夠穿透活藻細胞完整的細胞膜與核酸物質結合產生 520 nm（綠色）熒光（Haugland，1998）．染料PI只能穿透結構受損的藻細胞膜與其核酸物質結合，產生617 nm（紅色）熒光（Jones and Senf, 1985）．配制染料是，先用Milli-Q水將SYBR試劑（Sigma-Aldrich公司，濃度v:v/1:10000）稀釋成為1:100（V:V）的儲備液，于-20 °C保存．稱取定量PI粉末，用Milli-Q水溶解配制成為濃度1 mmol·L-1的儲備液，于4 °C保存．染色藻細胞時，向1 mL藻液中分別加入10 μL的SYBR儲備液和PI儲備液，在黑暗室溫條件下孵育15 min，樣品經過50 μm篩絹過濾后用流式細胞儀檢測．采用正置熒光顯微鏡（BX61，Olympus公司，日本）熒光視野下觀察（激發波長460～490 nm）染色后藻細胞樣品，如圖2所示，其中紅色點為PI染色的死細胞，綠色點為SYBR染色的活細胞．熒光視野下觀察能區分雙染色細胞，但難以分別計數．

圖1 添加計數微球后銅綠微囊藻細胞計數圖

圖2 SYBR和PI染色后銅綠微囊藻細胞死/活狀態

本研究中，流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）測定藻細胞死活狀態時采用488 nm激發波長．采用FL1通道收集SYBR熒光，FL3通道收集 PI熒光，分別表征活細胞和死細胞（Falcioni et al., 2008），如圖2所示．檢測每個樣品時，FL1通道和FL3通道至少須檢測到10000個藻細胞，FL2通道至少須檢測到 1500個藻細胞．采用Cell-Quest軟件（Becton Dickinson公司，美國）分析對流式細胞儀數據．

藻細胞死/活狀態由死細胞百分數（Pmd）表示，其計算公式為：

1.4 應用流式細胞術分析紫外消毒處理藻樣

采用準平行光束儀對銅綠微囊藻和橢圓小球藻進行 UV-C輻照處理，模擬紫外消毒除藻效果．紫外輻照劑量設為0、50、200 mJ·cm-2．具體輻照步驟參照本課題組此前報道[7]．經輻照處理后將藻液正常培養，在輻照處理后2 h內（記為0，1 ，3 ，5，7 ，9 d）取樣，采用所建立的流式細胞術分析藻細胞數量和死/活狀態．

2 結果與討論

2.1 藻液的流式細胞術計數與顯微計數

在純培養銅綠微囊藻對數生長期內定期取樣，采用流式細胞術及顯微鏡計數法進行細胞計數，結果如圖3所示．結果表明，培養期內藻細胞由初始值 1×106個·mL-1升高至 3×107個·mL-1，流式細胞術與顯微計數的結果具有較好的線性相關性（R2=0.980）．計數同一個樣品，顯微鏡計數須數十分鐘，其樣品前處理還需要48 h，而流式細胞術計數耗時低于 5 min，無需前處理，計數工作所需時間大為縮短．

2.2 藻細胞死/活狀態流式細胞術

梯度配比熱處理藻細胞（100 °C，10 min），經SYBR和PI雙染色，采用流式細胞術分析細胞死活狀態，結果如圖4所示．經流式細胞儀測定的死細胞比率與熱處理細胞的配比精確吻合，銅綠微囊藻液擬合曲線的R2值達0.999，橢圓小球藻液擬合曲線的R2值達0.995．采用流式細胞儀測定銅綠微囊藻和橢圓小球藻細胞死/活狀態的方法精確有效．

圖3 銅綠微囊藻液的流式細胞術計數與顯微計數結果對比

圖4 梯度配比熱處理藻細胞樣品中銅綠微囊藻與橢圓小球藻細胞死/活狀態

2.3 應用流式細胞術分析紫外消毒處理藻樣

紫外消毒處理后，采用流式細胞術計數藻細胞．其中銅綠微囊藻藻細胞數變化如圖5a所示．9 d培養期內，對照組呈指數增長趨勢．經過50和200 mJ·cm-2紫外消毒處理后，細胞數于5 d內未出現顯著變化．其后50 mJ·cm-2處理組于第7 d開始顯著升高，至第 9 d達到對照組水平的33%．200 mJ·cm-2UV-C處理組于9 d內保持初始水平，至第9 d時為對照組水平的5%．紫外消毒處理后，橢圓小球藻細胞數變化如圖5b所示．9 d培養期內，對照組呈現指數增長趨勢．紫外消毒處理組的細胞數變化趨勢相似，0.1～1 d內略有降低，2～9 d內迅速升高．第9 d時50、200 mJ·cm-2處理組的細胞數分別為對照組的81%和67%．以上結果說明，紫外消毒能夠抑制出水中銅綠微囊藻的生長，對于橢圓小球藻無抑制效果．流式細胞術能夠精確計數銅綠微囊藻和橢圓小球藻．

圖5 紫外消毒后藻細胞數變化（5a為銅綠微囊藻，5b為橢圓小球藻）

紫外消毒處理后，采用流式細胞術分析藻細胞死/活狀態，死細胞比率變化以損傷細胞百分數（Pmd）表示．其中銅綠微囊藻的檢測結果如圖6a所示．紫外消毒處理結束時，即0.1 d時，各UV-C處理組與對照組之間均無顯著性差異．這說明≤200 mJ·cm-2紫外消毒處理不會造成短時間內細胞破裂死亡．9 d培養期內，對照組Pmd值始終保持在（3±2）%的較低水平．50 mJ·cm-2處理組Pmd值逐漸升高，至第9 d達到（14±2）%．200 mJ·cm-2處理組Pmd值自第3 d迅速升高，至第5 d達到最大值（92±2）%．此后Pmd值逐漸降低，至第9 d時降至（76±7）%．水樣中橢圓小球藻死細胞比率變化如圖6b所示．對照組Pmd值始終保持 2%～3%水平．50、200 mJ·cm-2處理組的 Pmd值隨培養時間延長而逐漸升高，至第7 d時分別達到最大值6.0%和14.9%，其后逐漸降低．結果表明，較高劑量（200 mJ·cm-2）紫外消毒處理造成超過70%～90%的銅綠微囊藻細胞裂解死亡，但對橢圓小球藻無顯著致死影響．流式細胞術能夠靈敏檢測銅綠微囊藻和橢圓小球藻的死/活狀態．

圖6 紫外消毒后水樣中死亡藻細胞比率變化（5a為銅綠微囊藻，5b為橢圓小球藻）

3 結 論

1）流式細胞術能夠精確計數銅綠微囊藻和橢圓小球藻，計數結果與顯微計數結果具有較好的線性相關性（R2=0.980），采用流式細胞術使單樣品操作時間縮短至5 min以內．

2）流式細胞術能夠靈敏檢測銅綠微囊藻和橢圓小球藻的死/活狀態，經流式細胞儀測定的死細胞比率與熱處理死亡細胞的配比值精確吻合，銅綠微囊藻液擬合曲線的R2值達0.999，橢圓小球藻液擬合曲線的R2值達0.995．

3）所建立的流式細胞術能靈敏檢測紫外消毒處理后的藻細胞數及死/活狀態．

[1] 王占生，劉文君．微污染水源飲用水處理[M]．北京：中國建筑工業出版社，1999．

[2] Lei Li, Naiyun Gao, Yang Deng, et al. Characterization of intracellular & extracellular algae organic matters(AOM) of Microcystis aeruginosa and formation of AOM-associate disinfection byproducts and odor & taste compounds[J]. Water Research, 2012，46：1233-1240．

[3] 黃祥飛，陳偉民，蔡啟銘．湖泊生態調查觀測與分析[M]．北京：中國標準出版社，1999．

[4] 于洋，孔繁翔，史小麗．柵藻對金屬離子的異質敏感性與其細胞周期的關系[J]．環境科學，2006，27（6）：1197-1200．

[5] 譚嘯，孔繁翔，曹煥生，等．利用流式細胞儀研究溫度對兩種藻競爭的關系[J]．湖泊科學，2006，18（4）：419-424．

[6] 甘南琴，黃群，鄭凌凌，等．熒光原位雜交技術和流式細胞儀用于環境樣品中產毒及費產毒微囊藻的定量監測[J]．中國科學：生命科學，2010，40（3）：250-259．

[7] Tao Y, Zhang X H, Doris W T A, et al. The Effects of Sub-lethal UV-C irradiation on Growth and Cell Integrity of Cyanobacteria and Green Algae[J]. Chemosphere,2010，78：541-547．