頭穴叢刺對慢性腦缺血大鼠學習記憶能力及TH表達的影響

孫遠征，許 娜，王雅青

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

慢性腦供血不足是由多種原因引起的長期的腦供血不足導致的腦代謝障礙和功能衰退的一種病理過程，早期表現為一個或多個認知領域功能障礙，最終進展為血管性癡呆(vascular dementia，VD)、動脈硬化性白質腦病(Binswanger病)等多種腦血管疾病[1]。自上個世紀90年代以來關于慢性腦供血不足的病理機制及其治療的研究日益受到重視，有效干預慢性腦供血不足的進展對于預防上述腦血管疾病的發(fā)生有重大意義。而迄今的研究結果表明，現有治療手段多為針對血管性癡呆，而缺乏對本病理狀態(tài)的特異性治療手段[2]。本課題采用于致順老師的頭穴叢刺方法干預慢性腦缺血大鼠，觀察對學習記憶能力及相關蛋白表達的影響，為臨床干預慢性腦供血不足所致認知功能障礙提供新的思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠65只，體重180～230 g，動物及飼料均由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。實驗前適應性馴養(yǎng)1周，室溫及濕度保持23℃、70%左右。

1.2 藥品及試劑

尼莫地平片(天津市中央藥業(yè)有限公司)，兔抗大鼠TH抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋試劑公司)。

1.3 儀器與設備

Morris水迷宮由安徽淮北正華生物儀器設備有限公司提供;華佗牌針灸針規(guī)格:0.30 mm×13 mm。

2 實驗方法

2.1 動物分組

65只大鼠中淘汰游泳能力差和智力低下的大鼠3只后，隨機分為假手術組10只和手術組52只。術后4周進行第2次Morris水迷宮實驗，統(tǒng)計大鼠逃避潛伏期及平臺所在象限游泳路程，淘汰超出空白對照組范圍的大鼠，剩余2VO手術組27只大鼠，隨機分為模型組9只、頭針組9只、藥物組9只。

2.2 造模方法

采用Sarti等[3]改良的2VO，分次結扎大鼠雙側頸總動脈。大鼠術前12 h禁食，4 h禁水。麻醉方法以大鼠每千克體重300 mg10%水合氯醛，給予腹腔注射。大鼠進入麻醉狀態(tài)后，將其仰臥位固定，依次于頸前術區(qū)去毛，碘伏消毒，手術側頸部切開約1～2 cm，鈍性分離頸總動脈，采用0號線依次結扎頸總動脈近心、遠心端，確保結扎牢固后，用眼科剪將頸總動脈從兩個結扎點中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈血流，剪斷后，局部消毒，逐層縫合。手術過程保證體溫及呼吸的穩(wěn)定。手術后動物置于保溫的單籠飼養(yǎng)。1周后采用同法結扎另一側頸總動脈。術后每日腹腔注射青霉素20萬單位/kg，連續(xù)7天。假手術組手術方法及術后飼養(yǎng)方法同手術組，但僅分離暴露頸總動脈而不結扎。

各組大鼠予以相同環(huán)境、飼料、供水條件飼養(yǎng)4周。

2.3 水迷宮測試

采用英國心理學家Morris于20世紀80年代設計并應用于學習記憶腦研究的水迷宮系統(tǒng)[4]，分別于術前、術后4周、術后8周對各組大鼠進行水迷宮試驗。水迷宮試驗共4天，前3天定位航行，記錄各組每只大鼠逃避潛伏期(s)，即從大鼠入水到找到并爬到平臺上的時間，最長時間記為120 s，逃避潛伏期越短，說明大鼠的學習能力越好;第4天空間探索，記錄撤出平臺后于平臺所在象限游泳路程。

2.4 各組處理

假手術組、模型組:不予以任何處理，飼養(yǎng)方法同前。

頭針組:術后第5周開始治療，以頭穴叢刺理論為核心，參照《實驗動物穴位圖譜》取大鼠的百會穴，并取百會左右各旁開2 mm共3個穴位，從后向前平刺6～8 mm，每15 min捻針1次，100轉/min左右，每次持續(xù)捻轉3 min，留針30 min，每日1次，每天同一時段治療，共治療4周。

藥物組:術后第5周開始，進行尼莫地平灌胃治療。0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解尼莫地平片，配成尼莫地平濃度為 0.02%的懸浮液，按大鼠體重1 mg/kg灌胃，每天1次，與頭針組同一時段進行，連續(xù)治療4周。

2.5 灌注取材

術后8周后，采用Morris水迷宮，定向航行試驗與空間探索試驗分別檢測各組大鼠的學習記憶能力，數據整理后，采用多聚甲醛對各組大鼠進行固定處理，斷頭取腦，石蠟包埋，切片，分別進行HE染色及免疫組化驗查。

2.6 統(tǒng)計分析

所有數據均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理，進行方差齊性分析，單樣本t檢驗，數據以±s表示，P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 行為學結果分析

3.1.1 造模結果 術后4周除假手術組外各組大鼠逃避潛伏期均明顯延長，與假手術組相比(P＜0.05)差異具有統(tǒng)計學意義;平臺所在象限游泳路程明顯縮短，與假手術組相比(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。說明造模成功。見表1、表2。

表1 術后4周各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s)

表1 術后4周各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s)

注:與假手術組比較，*P ＜0.05。

分組 例數 術后4周假手術組9 9.21 ±2.31模型組 10 20.39 ±4.53*頭針組 9 23.21 ±3.89*藥物組 9 21.15 ±4.31*

表2 術后4周各組大鼠平臺所在象限游泳路程比較(±s，cm)

表2 術后4周各組大鼠平臺所在象限游泳路程比較(±s，cm)

注:與假手術組比較，*P ＜0.05。

周路程假手術組分組 例數 術后4 9 1119.85 ±150.04模型組 10 979.88 ±101.20*頭針組 9 953.63 ±90.69*藥物組 9 876.65 ±77.15*

3.1.2 治療后行為學結果 ①學習能力方面:頭針組和藥物組較模型組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，有明顯的統(tǒng)計學意義(P＜0.01);頭針組與藥物組相比大鼠逃避潛伏期無明顯差異，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。②記憶能力方面:頭針組、藥物組與模型組比較大鼠原平臺所在象限游泳路程明顯延長，具有明顯的統(tǒng)計學意義(P＜0.01);頭針組與藥物組比較大鼠原平臺所在象限游泳路程無顯著差異(P＞0.05)。見表3、表4。

表3 術后8周各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s)

表3 術后8周各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s)

注:與模型組比較，*P ＜0.01;與藥物組比較，ΔP ＞0.05。

分組 例數 逃避潛伏期假手術組9 8.04 ±2.72模型組 10 28.47 ±6.19頭針組 9 17.53 ±5.02*藥物組 9 18.09 ±3.75＊△

表4 術后8周各組大鼠第一象限游泳路程比較(±s，cm)

表4 術后8周各組大鼠第一象限游泳路程比較(±s，cm)

注:與模型組比較，ΔP ＜0.01;與假手術組比較，*P ＜0.05。

分組 例數 術后8周假手術組9 1153.19 ±107.66模型組 10 835.49 ±86.33*頭針組 9 988.63 ±105.34Δ藥物組 9 978.37 ±99.35Δ

3.2 病理學結果

3.2.1 HE染色結果 假手術組:額葉皮層及海馬細胞數目多，排列緊密有序，形態(tài)正常，細胞質染色均勻而色淺，核仁清晰。模型組:額葉皮層及海馬細胞數目明顯減少，排列疏松，形態(tài)不規(guī)則，細胞周圍間隙明顯，胞質不均而著色較深，可見空泡形成，核仁固縮顯示不清，并見碎片形成。頭針組及藥物組:額葉皮層及海馬細胞數目較多，排列緊密，染色均勻而淺，少見形態(tài)不規(guī)則、胞質不均、著色較深、核仁欠清晰的固縮細胞。見圖1～8。

3.2.2 免疫組化結果 在400倍顯微鏡下，按顯色的比例統(tǒng)計陽性細胞占細胞總數的百分比。以胞漿內粉紅色至棕黃色染色為陽性表達。模型組TH的表達較假手術組明顯上調(P＜0.05);頭針組、藥物組TH的表達較模型組明顯上調(P＜0.05);頭針組與藥物組TH的表達無顯著差異(P＞0.05)。見表5及圖9～16。

表5 術后8周各組大鼠TH陽性細胞數百分比(±s，%)

表5 術后8周各組大鼠TH陽性細胞數百分比(±s，%)

注:與假手術組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，＊＊P ＜0.05。

cortex hippocampus假手術組分組 例數9 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型組 10 48.3 ±2.7* 45.8 ±3.1*頭針組 9 78.6±5.1＊＊ 81.2±4.7＊＊藥物組 9 79.4±3.6＊＊ 74.4±4.3＊＊

圖1 假手術組大鼠額葉HE染色

圖2 假手術組大鼠海馬HE染色400

圖3 模型組大鼠額葉HE染色

圖4 模型組大鼠海馬HE染色400

圖5 頭針組大鼠額葉HE染色

圖6 頭針組大鼠海馬HE染色400

圖7 藥物組大鼠額葉HE染色

圖8 藥物組大鼠海馬HE染色400

圖9 假手術組大鼠額葉TH表達

圖10 假手術組大鼠海馬TH表達

圖11 模型組大鼠額葉TH表達

圖12 模型組大鼠海馬TH表達

圖13 頭針組大鼠額葉TH表達

圖14 頭針組大鼠海馬TH表達

圖15 藥物組大鼠額葉TH表達

圖16 藥物組大鼠海馬TH表達

4 討論

學習記憶能力與復雜的神經生理及生物化學機制相關，其中神經遞質對于學習記憶的形成和維持具有非常重要的作用。蘭光明[5]經過研究發(fā)現，多巴胺系統(tǒng)功能紊亂是認知功能障礙發(fā)病的重要機制之一。而酪氨酸羥化酶TH主要分布在多巴胺能神經元和去甲腎上腺素能神經元，是哺乳動物體內兒茶酚胺(catecholamines，CA)類神經遞質體內生物合成過程中的限速酶。其活性受體內外多重因素影響，有短周期調節(jié)與長周期調節(jié)兩種機制[6]。慢性腦供血不足使大腦處于缺血缺氧的狀態(tài)而導致神經元變性，通過短周期調節(jié)機制即負反饋作用，使TH表達上調。本實驗中，頭穴叢刺對TH表達的影響可能與長周期調節(jié)機制有關。國內外研究表明[7－8]，低氧狀態(tài)可提高TH mRNA轉錄速率和TH mRNA的穩(wěn)定性，增強胞漿蛋白與TH mRNA 3'端未翻譯區(qū)域的結合，保護mRNA免受核酸酶的作用而降解，從而上調TH的表達，使多巴胺等兒茶酚胺類神經遞質合成增多，作為自發(fā)性保護學習記憶能力。已有研究[9]表明，鈣離子通道阻滯劑尼莫地平有一定的神經保護作用，可以改善認知功能，并已經被有效地運用于臨床實踐中。

頭穴叢刺法是我校于致順老教授從事針灸事業(yè)40余年從臨床實踐中總結出來的，對中風等各種中樞神經系統(tǒng)疾病有顯著療效，于教授[10]認為，針具刺入后，產生一定的“場”，直接作用干大腦皮層及有關部位，改善了這些部位的病理變化。并經過研究證明，針捻轉后能產生運動誘發(fā)電位，對相關神經功能的遠端部位產生點沖動刺激。近年來關于頭穴叢刺治療范圍的研究以及機理的研究也日益增多[11－15]。筆者在本次研究中認識到:①分次結扎雙側頸總動脈術可以成功制作慢性腦缺血大鼠，并且死亡率較低;②頭穴叢刺可以明顯保護慢性腦缺血大鼠的學習記憶能力，其機制可能與上調TH的表達有關;③頭穴叢刺法與尼莫地平治療慢性腦缺血大鼠的療效相當，其差異不具有統(tǒng)計學意義。

本實驗在眾多研究的基礎上，采用頭穴叢刺方法干預慢性腦缺血模型大鼠，觀察其學習記憶能力以及TH表達的變化。經實驗可以推論，頭穴叢刺確有保護慢性腦缺血大鼠學習記憶能力的作用，其機制可能與上調TH的表達有關。

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