環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測痰標本中結核分枝桿菌的初步評價

于 霞，梁 倩，馬異峰，付育紅，黃海榮

（北京市結核病胸部腫瘤研究所，首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院，北京101149）

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的流行最廣的傳染性疾病。全球每年新發(fā)結核患者800－1000萬，有180萬人死于結核病［1］。涂片和培養(yǎng)是結核病診斷最為直接和可靠的診斷依據(jù)，但其自身的不足已嚴重影響實驗室技術對結核病防治的價值。傳統(tǒng)診斷技術的不足主要有：（1）診斷技術敏感性低，涂片鏡檢對菌陽標本的檢出率只有40%－50%。（2）分枝桿菌培養(yǎng)雖然較涂片鏡檢的檢出率高，能達到85%，但耗時長，通常需要6－8周。

由于分子生物學診斷技術逐步被開發(fā)，其敏感性和特異性以及實用性已經得到認可。環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術就是其中之一，該技術通過特異的引物與結核分枝桿菌染色體DNA的DNA gyrase subunit B （gryB）以 及insertion sequence（IS6110）區(qū)域結合，采用2對引物識別6個區(qū)域，在恒溫條件下進行擴增［2］。該技術的優(yōu)點為特異性高，擴增反應效率高，時間短產物量大，不需昂貴的儀器，操作簡易性好。

1 材料與方法

1.1 標本收集 收集本院2012年6－8月的疑似肺結核患者的痰標本246份。年齡范圍18到88歲，平均年齡49歲，男179份，女67份。經臨床診斷確診的結核病患者標本213例，其他肺部疾病標本33例。

1.2 分枝桿菌培養(yǎng)和涂片 對收集的痰標本進行熒光法涂片鏡檢，痰標本的收集和涂片鏡檢按照《痰涂片鏡檢質量保證手冊》進行操作。中性羅氏培養(yǎng)基的制作見參考文獻［3］，取1ml痰標本，加入1－1.5倍體積4%用N－乙酰－L－半胱氨酸－氫氧化鈉溶液進行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋震蕩10－20 s，直至痰標本充分液化。將離心管室溫靜置15 min，加入PBS中和至體積為40ml，3 000g離心15 min。取100μl處理后的樣品分別接種至中性羅氏培養(yǎng)基斜面上。每份標本平行接種至兩管中性羅氏培養(yǎng)基。37℃溫箱培養(yǎng)，每周觀察記錄結果。

1.3 菌種鑒定 采用杭州創(chuàng)新生物檢控技術有限公司生產的結核分枝桿菌快速診斷試劑盒（膠體金）對羅氏培養(yǎng)陽性的痰標本進行菌種鑒定。試劑盒原理為結核分枝桿菌生長時產生分泌型蛋白MPB64，而非結核分枝桿菌（Non－tuberculosis mycobacteria，NTM）不會產生MPB64。質控和測試條帶均為紅色時，樣本中含結核分枝桿菌；只有質控條帶為紅色時，樣本中含有NTM。

1.4 實時熒光核酸擴增（RT－PCR） 采用達安基因股份有限公司生產的結核分枝桿菌DNA提取試劑盒進行核酸提取，然后按照標準曲線試劑盒進行操作，使用實時熒光核酸擴增儀（ABI7500）進行擴增，按試劑盒說明進行檢測。

1.5 環(huán)介導的等溫擴增技術（LAMP）

1.5.1 DNA提取 采用核酸快速提取試劑盒（榮研生物科技（中國）有限公司），該試劑盒通過對樣本中所含的細菌進行破碎處理，使其所含的核酸游離到溶液中，并將得到的溶液與吸附劑試劑管中的多孔介質混合，把樣本中所含的阻礙核酸擴增反應的物質去除，在通過滴注蓋薄膜濾器，使核酸溶液被提取出來。

1.5.2 LAMP擴增 將30μl的核酸溶液加到反應試管中；將恒溫器在67℃加熱40min；40min后再用加熱器進行酶的滅活，80℃，5min。結果判定：使用紫外照射燈管從反應試管的地面進行紫外照射。在確認陽性對照發(fā)出綠色熒光，陰性對照溶液沒有發(fā)出熒光后，對待測樣本結果進行判讀。陽性：發(fā)出綠色熒光。陰性：未發(fā)出綠色熒光。

1.6 臨床診斷 依據(jù)中華醫(yī)學會結核病學分會《肺結核診斷和治療指南》［4］。

1.7 統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，LAMP與RT－PCR法檢測結果比較用配對χ2檢驗；LAMP與RT－PCR法檢測結果一致性分析采用Kappa指數(shù)法，Kappa系數(shù)值越大，說明吻合程度越高。Kappa指數(shù)在0.4－0.7，提示吻合程度一般，大于0.7，說明吻合性強。

2 結果

2.1 4種方法的檢出率

痰涂片，痰羅氏培養(yǎng)，LAMP擴增以及RTPCR四種方法對分枝桿菌的檢出率依次為30.89%（76／246），45.53%（112／246），54.47%（134／246），57.32%（141／246）。RT－PCR 的檢出率最高，其次為LAMP。LAMP與RT－PCR在結核分枝桿菌檢出率上的差異無統(tǒng)計學意義（配對χ2檢驗結果，P＝0.189，P＞0.05）。LAMP法與涂片法在結核分枝桿菌檢出率上的差異有統(tǒng)計學意義（配對χ2檢驗結果，P＜0.001）。LAMP法與培養(yǎng)法在結核分枝桿菌檢出率上的差異有統(tǒng)計學意義（配對χ2檢驗結果，P＜0.001）。

2.2 菌種鑒定結果 對于羅氏培養(yǎng)陽性的112株分枝桿菌進行膠體金試劑盒鑒定，其中7株（7／112，6.25%）株為NTM，其余105株為結核分枝桿菌。

2.3 LAMP法與羅氏培養(yǎng)法檢測結果的比較 對于膠體金鑒定為NTM的7株菌株，在進行LAMP法與羅氏培養(yǎng)的比較時排除這7株菌株。以羅氏培養(yǎng)結果作為金標準，LAMP法診斷的敏感性為96.19%（101／105），特異性為76.87%（103／134），兩法檢測結果的一致性是κ＝0.711，說明LAMP法在檢測結核分枝桿菌方面與羅氏培養(yǎng)法有較好的吻合性。兩法檢測結果的比較見表1。

表1 LAMP法與羅氏培養(yǎng)法檢測結果的比較

2.4 LAMP法與涂片法、RT－PCR法以及臨床診斷結果的比較

以RT－PCR作為診斷標準，LAMP法的敏感性為90.07% （127／141），特異性為93.33% （98／105），兩法檢測結果的一致性是κ＝0.83，說明LAMP法在檢測結核分枝桿菌方面，與RT－PCR法有很好的吻合性。以涂片結果作為金標準，LAMP的敏感性為96.05%（73／76），特異性為64.12%（109／170）。以臨床診斷作為金標準，LAMP的敏感性為62.74%（133／212），特異性為97.06%（33／34）。LAMP法與其他3種方法比較，見表2。來自不同臨床診斷類型的痰標本，四種不同檢測方法的檢出率如表3所示。

表2 LAMP法與涂片、RT－PCR和臨床診斷結果的比較

其他非結核性疾病包括肺癌5例，胸腔積液3例，肺炎4例，支氣管擴張合并感染1例，多漿膜腔積液1例。

表3 四種不同檢測方法對于來自不同臨床診斷類型標本的檢出率

3 討論

根據(jù)全國結核病耐藥性基線調查報告，NTM在培養(yǎng)陽性菌株中所占的比例為3.4%［5］。在本研究中，NTM在培養(yǎng)陽性菌株中的比例約6.25%（7／112）%。LAMP技術的引物設計在結核分枝桿菌染色體DNA的gryB以及IS區(qū)域內，從理論上講，只能對結核分枝桿菌進行診斷而無法識別NTM菌株。因此計算LAMP與培養(yǎng)的一致性時，應該先排除NTM菌株的影響。在7株經膠體金鑒定為NTM的菌株中有2株的LAMP法和RT－PCR均為陽性且臨床診斷均為結核病，提示這兩份標本可能存在混合感染，即一份痰標本中同時含有結核和NTM。因此，當LAMP結果為陽性且膠體金為陰性時，提示檢測樣本可能存在混合感染。

一系列的研究表明，LAMP法與培養(yǎng)法有著較好的吻合率。劉毅［6］等研究表明以培養(yǎng)法為金標準，選取121份痰標本，LAMP法的敏感性和特異性分別為92.16%和87.14%。易海華［7］等研究選取65份痰標本，以培養(yǎng)法為金標準，LAMP法的敏感性和特異性分別為96.4%和94.59%。包維華［8］等研究，選取118份痰標本，以培養(yǎng)法為金標準，LAMP法的敏感性和特異性分別92%和86.8%。戴廣明等［9］研究表明選取了79株臨床和標準菌株，與培養(yǎng)相比，LAMP法實驗的靈敏度和特異性分別為100%和92%。Geojith George等研究表明在涂片和培養(yǎng)結果一致的標本中，LAMP方法很有效［10］。同時，LAMP技術對于腦脊液標本也有很高的檢出率［11］，與臨床診斷的敏感性和特異性分別為52.9% 和90%。本實驗以羅氏培養(yǎng)結果作為金標準，LAMP法診斷的敏感性為96.19%（101／105），LAMP的特異性為76.87%（103／134），兩種方法檢測結果的一致性是κ＝0.71。

痰標本的細菌載量在5000－10000條／ml，涂片鏡檢才會報告陽性。而痰培養(yǎng)得細菌載量在100條／ml以上，培養(yǎng)會報告陽性［12］。本實驗所用的LAMP的最低檢出限為0.38基因組／測試。因此，涂片培養(yǎng)陰性并不代表痰標本中沒有結核分枝桿菌，有可能是由于細菌的數(shù)量低于檢測限造成的。在結核分枝桿菌檢出率上，LAMP法（134／246，54.47%）要高于涂片法（76／246，30.89%）和羅氏培養(yǎng)法（112／246，45.53%），且差異有統(tǒng)計學意義。

LAMP法與RT－PCR在檢出率上的差別沒有統(tǒng)計學意義（P＝0.189），兩法檢測結果的一致性是κ＝0.83。RT－PCR已經作為一種輔助檢查項目在國內的醫(yī)院廣泛開展，其結果也可以作為菌陰肺結核的診斷指標之一［4］，檢測時間約為3個小時，但需要價格較為昂貴的設備，通過對擴增反應曲線圖譜來判讀結果，對操作人員的技術要求較高。LAMP試劑盒可以在2小時內報告結果，且僅需顏色的變化來判讀結果，操作更為簡單。因此，LAMP法適合作為臨床檢測項目開展。

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