蛋白TLR4在人胰腺癌組織中的表達(dá)及其病理特征相關(guān)分析

黃 喆 郭克建 何三光 劉 放 林 杰

Toll樣受體家族(toll like receptors，TLRs)是 1 種跨膜受體，它主要決定果蠅的腹背側(cè)體軸發(fā)展的方向性及非特異性的免疫反應(yīng)。Medzhitov等［1］于1997年在人類(lèi)第一次發(fā)現(xiàn)于果蠅Toll蛋白相類(lèi)似的人類(lèi)TLR，即TLR4。目前已知的TLR家族成員共11個(gè)［2］。TLR家族廣泛表達(dá)與哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表面，是主要感受病原體入侵的受體，也是天然的免疫分子，其不僅能表達(dá)在免疫細(xì)胞當(dāng)中，也能表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞當(dāng)中［3］。腫瘤細(xì)胞中TLRs激活不但能增加細(xì)胞的凋亡及增殖抵抗，還能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃避、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移［4］。然后，TLR4表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等相關(guān)性目前仍不甚清楚，本組研究對(duì)胰腺癌患者中的TLR4表達(dá)情況進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2008年1月至2010年1月收治的胰腺癌患者共66例，所有患者的臨床病理資料均完整。所有患者均給予手術(shù)治療，術(shù)前未行放療或化療，術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)。男性43例，女性23例。年齡33～75歲，平均(57.8±7.6)歲。胰頭癌40例，胰體尾癌26例。其中低分化腺癌31例，中分化腺癌23例，高分化腺癌12例。患者伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。腫瘤直徑＞3 cm者38例，≤3 cm者28例。按2002年國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)制定的TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分期:Ⅰ期9例，Ⅱ期21例，Ⅲ期31例，Ⅳ期5例。此外，收集36例癌旁距腫瘤5 cm內(nèi)、36例癌旁距腫瘤5 cm以上的正常胰腺組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)染色超敏兩步法(SP染色法)對(duì)不同胰腺組織中的TLR4蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，兔抗人TLR4多克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品，免疫組化SP試劑盒以及DAB顯色劑為武漢博士德生物科技有限公司產(chǎn)品。具體操作嚴(yán)格按照SP免疫組化試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用PBS替代一抗為陰性對(duì)照，其中TLR4蛋白陽(yáng)性染色分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中，顯示為棕黃色。隨機(jī)觀察5個(gè)不同的高倍視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞率以及陽(yáng)性染色的強(qiáng)度判斷染色結(jié)果［5］。其中陽(yáng)性細(xì)胞率≥50%為3分，30%～49%為2分，6%～29%為1分，≤5%為0分。細(xì)胞染色棕褐色計(jì)3分，棕黃色計(jì)2分，淡黃色計(jì)1分，無(wú)染色計(jì)0分。其中5分及以上為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，3～4分為中等強(qiáng)度陽(yáng)性(++)，2分為弱陽(yáng)性(+)，0～1分為陰性(-)。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

評(píng)估分析TLR4表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、組織學(xué)分級(jí)、TNM分期等相關(guān)性，隨訪2年，分析TLR4表達(dá)與胰腺癌患者生存時(shí)間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同胰腺組織中TLR4蛋白表達(dá)情況

胰腺癌組織組TLR4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為71.2%，顯著高于癌旁組織組的(38.9%)和正常組織組的(0)，結(jié)果對(duì)比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同胰腺組織中TLR4蛋白表達(dá)情況/例

2.2 TLR4表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

TLR4表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及TNM分期與存在明顯相關(guān)性，P＜0.05，見(jiàn)表2。

2.3 胰腺癌組織中TLR4表達(dá)與患者生存時(shí)間的相關(guān)性

TLR4表達(dá)陽(yáng)性組平均生存時(shí)間(12.6個(gè)月)顯著短于陰性組(19.5個(gè)月)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 TLR4表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性/例

3 討論

Toll樣受體家族(toll like receptors，TLRs)是1種跨膜受體，它主要決定果蠅的腹背側(cè)體軸發(fā)展的方向性及非特異性的免疫反應(yīng)。TLR4是Toll樣受體家族的成員，是重要的免疫分子，能夠?qū)p傷分子模式及病原相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別。TLR家族廣泛表達(dá)與哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表面，是主要感受病原體入侵的受體，也是天然免疫分子，不僅能表達(dá)在免疫細(xì)胞中，也表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞中。TLR4主要在淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)，在機(jī)體的天然免疫過(guò)程中發(fā)揮巨大的作用［6-8］。此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TLR4在多種惡性腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中呈高表達(dá)，包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、肺癌、喉癌、前列腺癌、膽囊癌及胰腺癌［9-11］。金海敏等［12］采用 PCR法對(duì)大腸癌及癌旁組織中的TLR4表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TLR4在大腸癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織的表達(dá)。而且TLR4在大腸癌中的表達(dá)與VEGF、TGF-β的表達(dá)密切相關(guān)。Yang等［13］報(bào)道在人乳腺癌細(xì)胞系中，TLR1-TLR10均有不同程度的表達(dá)，其中TLR4表達(dá)為最高。Zhang等［14］研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在人胰腺癌組織中呈高表達(dá)(69.2%)，顯著高于對(duì)照組(39.5%)，表明TLR4 蛋白在胰腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。這些研究表明TLR4表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究對(duì)不同胰腺組織中TLR4蛋白表達(dá)對(duì)比分析，胰腺癌組織組TLR4蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為71.2%，顯著高于癌旁組織組(38.9%)和正常組織組(0)，有顯著差異(P＜0.05)。本研究結(jié)果表明胰腺癌組織中存在TLR4蛋白高表達(dá)，與胰腺癌存在著相關(guān)性。

關(guān)于TLR4促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，TLR4與胰腺癌組織病理相關(guān)性等目前均未完全闡明。本研究顯示在TLR4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析中，腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及TNM分期與TLR4高表達(dá)存在相關(guān)性(P＜0.05)。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，在腫瘤大小(D＞2.0 cm)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性(+)、血管侵犯陽(yáng)性(+)以及高TNM分期胰腺癌組織中，TLR4蛋白表達(dá)顯著升高，此次研究結(jié)果與Zhang等［14］研究結(jié)論一致。因此，TLR4蛋白在癌組織高表達(dá)與胰腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲及惡性程度均密切相關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中均起到了重要作用。此外，本研究對(duì)胰腺癌組織中TLR4表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)性分析顯示，TLR4蛋白表達(dá)陽(yáng)性組平均生存時(shí)間顯著低于陰性組(P＜0.05)。研究結(jié)果表明，TLR4高表達(dá)與胰腺癌患者的生存期呈負(fù)相關(guān)，故可作為判斷胰腺癌患者的預(yù)后指標(biāo)之一。

綜上所述，本研究顯示TLR4蛋白在胰腺癌組織中存在高表達(dá)與胰腺癌的轉(zhuǎn)移、侵襲以及惡性程度均密切相關(guān)，而且能夠促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展。由于胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移涉及到多個(gè)方面因素，胰腺癌組織的TLR4蛋白陽(yáng)性高表達(dá)在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中還有待進(jìn)一步深入研究。

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