TLR4基因在宮頸癌組織中的表達及其與HIF-1α的相關性

陳贛洪

炎癥是許多重要疾病的公共通路，而宮頸癌是病原體感染獲得性疾病，其發展經歷了從炎癥到上皮非典型增生再到癌變的階段。那么，病原體感染激活的天然免疫反應在宮頸癌進展過程中發揮了什么作用呢?天然免疫防疫系統的識別作用主要是由TLRs來完成的。其中TLR4不但識別外源的病原體，還可識別內源性物質及其降解產物［1］。其激活的TRAF6可以結合ECSIT，激活MAPK途徑，活化NF-кB和低氧誘導因子-1ɑ(hypoxia inducible factor-1ɑ，HIF-1α)信號［2］。本組研究TLR4和HIF-1α在宮頸病變組織中的表達趨勢及其相關性，以探索TLR4基因在宮頸癌發生發展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選自我院婦科2011年3月至2012年10月收治的經活檢病理檢查診斷為宮頸炎合并HPV感染、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期和宮頸癌的患者。行陰道鏡檢測同時，取宮頸脫落細胞進行雜交捕獲(Hybridization Capture)HPV DNA分析，確定HPV 16感染才記入。所有患者為初發患者。每組20例，同時以健康無HPV感染的20例宮頸組織(如因子宮肌瘤、功血等切除子宮)作為對照組。

1.2 方法

將新鮮組織置于液氮中保存，實驗前研磨成粉末后，取0.5 g勻漿研碎組織裂解后提取總 RNA，純度A260/A280在1.8～2.2，逆轉錄后再行 PCR 擴增，產物凝膠電泳后用凝膠成像系統分析。內對照β-actin的mRNA分別與TLR4和HIF-1α的mRNA在同一體系共同擴增，以降低干擾因素對實驗結果的影響，凝膠在圖像系統上分析出所有mRNA的密度后，將β-actin的密度作為內對照，目的基因與內對照的密度之比為目的基因表達的相對值。每組實驗重復3次，取平均值。TLR4上游引物 5＇-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC，下游引物 3＇-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA;HIF-1α 上游引物 5＇-TCAAAGTCGGACAGCCTCA，下游引物 3＇-CCCTGCAGTAGGTTTCTGCT;β-actin 上游引物 5 ＇-AAGAGAGGCATCCTCACCCT，下游引物3 ＇-TACATGGCTGGGGTGTTGAA。

1.3 統計學方法

所有數據應用SPSS13.0軟件統計，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 TLR4 RNA含量的變化

RT-PCR檢測結果顯示，從正常宮頸組織→感染HPV16的宮頸炎性組織→CIN組織→宮頸癌組織，TLR4表達量逐漸增加，對照組顯著減少。經灰度值分析，各組TLR4表達值見表1，經統計分析，差異非常顯著(表1、圖1)。

圖1 RT-PCR檢測TLR4基因在各組宮頸組織中的表達

2.2 HIF-1αRNA 含量的變化

經灰度值分析，各組織中HIF-1α表達值見表1，經統計分析，差異非常顯著(表1、圖2)。

圖2 RT-PCR檢測HIF-1α基因在各組中的表達情況

2.3 宮頸癌組織中TLR4和HIF-1α表達的相關性

對宮頸癌組織中TLR4和HIF-1α的基因含量進行雙因素相關性分析，結果γ=0.491，表示兩者呈正相關性，經對相關系數的假設檢驗，P＜0.05。

3 討論

研究表明TLR4在許多皮膚黏膜表面表達，通過識別病原微生物激活天然免疫防疫反應，調控致炎因子的釋放，在皮膚及黏膜的免疫反應中發揮重要的作用。同時，其介導了炎癥反應是許多重要疾病、特別是腫瘤發生的公共通路［3］。

HIF-1α是決定惡性腫瘤預后的重要因子，其過度激活可促進腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移，并誘導腫瘤細胞對化療和放療的抵抗［4］。臨床研究發現高表達HIF-1α宮頸癌患者2年生存率明顯低于低表達HIF-1α患者。我們前期研究亦發現，宮頸癌組織中HIF-1α表達明顯升高，轉染HIF-1α特異性小干擾RNA可顯著降低HIF-1α的表達，并減緩宮頸癌細胞在裸鼠中的生長［5］。

國外研究發現多種外源性因素和內源性炎癥介質上調HIF-1α的表達、聚集和活化，不同的細胞對不同微環境刺激，其HIF-1α表達調控并不一樣，即有細胞特異性和刺激原的依賴性［6］。絲裂原活化的蛋白激酶(P44/42MAPK)途徑干擾HIF-1α表達已被多個研究證實，而絲裂原活化的蛋白激酶的活化廣泛地受增殖和炎癥信號調控［7］;在單核細胞和巨噬細胞中，細菌的脂多糖(LPS)通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)誘導 P44/42 的活化，激活 NF B，調控HIF-1α轉錄水平，而識別細菌LPS的模式識別受體Toll-like receptor 4(TLR4)在很多疾病中都有高表達，其調控的信號通路不僅可以激發機體的先天免疫，同時對后續的繼發免疫反應發生發展具有一定的作用［8-9］。大量研究表明HIF-1α的高表達促進中性粒細胞和巨噬細胞增殖，抑制其凋亡，同時通過增加趨化因子的表達，誘導中性粒細胞和巨噬細胞由外周血遷移至局部皮膚，并調節炎癥介質(如IL-6、8和TNF-α)的合成和釋放。調控局部的炎性微環境，促進炎癥的發生發展，故HIF-1α又稱之為免疫感受器，具有導致和放大炎癥的作用，還可通過上調TLR表達維持機體的先天免疫［10-11］。故HIF-1α下游通路和TLR4信號通路通過正反饋效應相互作用，放大免疫反應，延續機體炎癥微環境。

本研究發現，從宮頸感染HPV病毒開始，到宮頸病變進展直至宮頸癌的過程中，TLR4和HIF-1α的表達含量逐漸升高，且差異均有顯著性意義。表明TLR4和HIF-1α參與了宮頸癌的發生發展。而相關性分析表明TLR4和HIF-1α在宮頸癌中的表達呈正相關的模式，說明TLR4在宮頸癌中的作用與HIF-1α有關。

表1 RT-PCR法檢測TLR4和HIF-1ɑ基因在各組中的相對含量(±s)

表1 RT-PCR法檢測TLR4和HIF-1ɑ基因在各組中的相對含量(±s)

基因 正常宮頸 宮頸炎 CIN 宮頸癌 F值 P值16.23 0.0041 HIF-1α 0.19 ±0.03 0.37 ±0.05 0.59 ±0.04 0.75 ±0.12 15.TLR4 0.32 ±0.02 0.48 ±0.03 0.65 ±0.04 0.83 ±0.12 42 0.0072

我們研究證明了TLR4和HIF-1α均參與了宮頸癌的致病過程，而TLR4的上升可能是宮頸癌發生的一個參與因素，其通過和HIF-1α的相互正反饋放大效應，促進了宮頸病變發展過程中的局部炎癥效應，參與了宮頸癌的發生。但TLR4在宮頸癌發生過程中的具體作用機制還需要進一步研究。

［1］Challa S，Woelfel M，Guildford M，et al.Viral cell death inhibitor MC159 enhances innate immunity against vaccinia virus infection〔J〕.J Virol，2010，84(20):10467.

［2］Ramanathan M，Luo W，Csóka B，et al.Differential regulation of HIF-1alpha isoforms in murine macrophages by TLR4 and adenosine A(2A)receptor agonists〔J〕.J Leukoc Biol，2009，86(3):681.

［3］Kutikhin AG.Impact of Toll-like receptor 4 polymorphisms on risk of cancer〔J〕.J Hum Immunol，2011，72(2):193.

［4］Nakamura M，Bodily JM，Beglin M，et al.Hypoxia-specific stabilization of HIF-1alpha by human papillomaviruses〔J〕.J Virology，2009，387(2):442.

［5］Oh JM，Ryoo IJ，Yang Y，et al.Hypoxia-inducible transcription factor(HIF)-1 alpha stabilization by actin-sequestering protein，thymosin beta-4(TB4)in Hela cervical tumor cells〔J〕.J Cancer Lettm，2008，264(1):29.

［6］Guo AM，Scicli G，Sheng J，et al.20-HETE can act as a nonhypoxic regulator of HIF-1alpha in human microvascular endothelial cells〔J〕.JAm J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(2):H602.

［7］Ramanathan M，Luo W，Csóka B，et al.Differential regulation of HIF-1alpha isoforms in murine macrophages by TLR4 and adenosine A(2A)receptor agonists〔J〕.J Leukoc Biol，2009，86(3):68.

［8］Djamiatun K，Ferwerda B，Netea MG，et al.Toll-like receptor 4 polymorphisms in dengue virus-infected children〔J〕.Am J Trop Med Hyg，2011，85(2):352.

［9］El-Hage N，Podhaizer EM，Sturgill J，et al.KF.Toll-like receptor expression and activation in astroglia:differential regulation by HIV-1 Tat，gp120，and morphine〔J〕.Immunol Invest，2011，40(5):498.

［10］Spirig R，Potapova I，Shaw-Boden J，et al.TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells〔J〕.Mol Immunol，2009，46(15):3178.

［11］Kim SY，Choi YJ，Joung SM，et al.Hypoxic stress up-regulates the expression of Toll-like receptor 4 in macrophages via hypoxia-inducible factor〔J〕.Immunology，2010，129(4):516.