原發性肝細胞癌組織中P21的亞細胞定位及其意義

易 玲 邱榮元 王松柏 劉崇梅 馮喜華 萬焱鑫 伍小瓊 何生松

原發性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第五大常見惡性腫瘤，在癌癥相關死亡原因中排名第三。盡管外科手術及肝移植治療取得了很大進展，但肝癌的預后仍不樂觀。

P21具有廣泛的細胞周期抑制活性，理論上其與肝癌的發生發展及預后密切相關，然而國內外對其預測價值意見很不一致。目前認識到P21具有不同的功能狀態，比如抑制細胞增殖與促進細胞增殖，抑制細胞凋亡與促進細胞凋亡。而P21的功能狀態與亞細胞定位密切相關。

本課題組前期研究中［1-3］，初步證實當P21定位于細胞質，胞質型P21促進HepG2細胞增殖、促進細胞周期運行、增強其抗凋亡能力。作為前期項目的延伸，本研究采用免疫組織化學的方法，檢測原發性肝細胞肝癌組織中P21表達情況及其亞細胞定位，并探討與臨床病理參數的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2007年2月至2012年9月岳陽市第二人民醫院、華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院收治的115例肝硬化基礎上發生的肝癌病例資料及手術切除于病理科存檔的石蠟包埋標本，其中包括同一病例的肝癌組織、癌旁組織、肝硬化組織。115例中，男性81例，女性34例;年齡16～71歲，平均年齡47歲，中位年齡 48歲;腫瘤直徑平均 5.6 cm(1.5～12 cm)。根據 Edmondson-Steiner標準分級:Ⅰ-Ⅱ級 48例(41.74%)Ⅲ-Ⅳ級67例(58.26%)。HBsAg陽性98例(85.21%)。

表1 P21陽性表達與HCC臨床病理特征的關系

1.2 主要試劑

鼠抗 P21W AF/CIP1單克隆抗體(Neo Markers);SP試劑盒、DAB顯色劑(北京中杉公司)。

1.3 方法

采用SP法，嚴格按照試劑盒操作說明進行P21免疫組化染色，采用檸檬酸高溫高壓法進行抗原修復，抗體稀釋度為1:200，DBA顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。以PBS和正常血清分別代替一抗與二抗作陰性對照。陽性細胞計數標準如下:每個位點隨機選取3個高倍鏡視野，平均每高倍鏡陽性細胞＜5% 為“－”，5%～25% 為“+”，26%～50% 為“++”，＞50% 為“+++”。P21W AF/CIP 1陽性染色為胞質型或核型，淡黃色、棕黃色或棕褐色，呈顆粒狀或團塊狀。

1.4 統計學方法

所有數據均用SPSS 13.0軟件包作統計處理。各組陽性表達率差異的比較及與臨床參數之間關系采用卡方檢驗;單因素相關分析采用Pearson相關法。多組之間的兩兩比較采用秩和檢驗法，求Hc值，推斷P值范圍。

2 結果

2.1 P21在肝臟不同組織中的表達

肝硬化組織中P21陽性表達率為10.43%(12/115)，原發性肝細胞肝癌組織中陽性率為35.65%(41/115)，癌旁組織為38.26%(44/115)，肝癌與癌旁組織相比，差異無統計學意義(P＞0.05)，肝癌與肝硬化組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)，癌旁與肝硬化組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 胞質型P21在肝臟不同組織中的表達

胞質型P21陽性率在癌旁組織中為6.82%(3/44)，在肝硬化組織中為8.33%(1/12)，在原發性肝細胞肝癌組織中為75.61%(31/41)。肝癌與癌旁組織及肝硬化組相比，胞質型P21陽性表達率的差異均有統計學意義(P＜0.01);而癌旁與肝硬化組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 胞質型P21與肝癌組織臨床特征的相關性

胞質型P21在肝癌組織中Ⅰ-Ⅱ級、Ⅲ-Ⅳ級的陽性率分別為 42.89%(6/14)，92.59%(25/27)，胞質P21的陽性表達與腫瘤細胞分化程度明顯負相關(γ=－0.42，P＜0.01)，胞質型 P21 在肝癌組織中無轉移及有轉移的患者中陽性率分別為73.07%(12/15)，80.00%(19/26)，胞質 P21與腫瘤轉移正相關(γ=0.27，P＜0.05)，而與年齡、HBSAg、腫瘤直徑無關(P＞0.05)。見表1。

3 討論

P21是el-Deiry等于1993年發現的1種能夠被p53轉錄激活的基因，編碼分子量為21 kDa的蛋白，因此命名為P21［4］。P21具有眾多蛋白質結合位點，其中某些部位相互重疊，如P21可與細胞周期素(cyclin)、細胞周期素依賴的蛋白酶(CDK)、增殖細胞核抗原(PCNA)、切冬酶原3(Procaspase 3)、MAPK家族分子、鈣調蛋白等相互作用，此外還有核定位信號(nuclear locational signal，NLS)、核輸出信號(nuclear export signal，NES)，從而影響其亞細胞定位［5］。

P21蛋白最初因其細胞周期抑制活性而為人們所熟知，因而人們將其歸屬為抑癌基因的范疇。目前關于P21功能的研究，認識到P21涉及到細胞的生長、分化、凋亡、老化。并且，P21具有不同的功能狀態，比如抑制細胞增殖與促進細胞增殖，抑制細胞凋亡與促進細胞凋亡［6-7］。而P21的功能狀態與某些位點的磷酸化、亞細胞定位密切相關［8］。

P21的抑癌功能與其核定位密切相關，而胞核P21的促進細胞生長及抗凋亡能力在許多細胞的研究中得到證實，如在急性單核細胞性白血病［9］、人乳腺癌［10］、神經腫瘤性疾患［11］。

當P21定位于細胞質，可與細胞凋亡信號分子相結合，如與Procaspase 3結合，阻止Fas介導的凋亡途徑［12-13］，并且通過抑制促凋亡激酶(apoptosis signalregulating kinase 1，Ask1)而使抗凋亡效應進一步放大［14］。Tanaka等發現［15］，胞質 P21 蛋白可與 Rho 激酶形成復合體并抑制其激酶活性，導致肌動蛋白應力纖維丟失，促進細胞外生性生長。在某些腫瘤性疾患中，也發現胞核P21蛋白表達與腫瘤浸潤和轉移的相關性，其機制可能為胞核P21抑制Rho激酶活性，肌動蛋白應力纖維丟失，細胞活動性增強，最終導致腫瘤的浸潤和轉移［11］。

目前關于P21的亞細胞定位與肝癌的關系，研究尚不多見，而關于P21與肝癌關系的報道極不一致，在肝癌組織中，P21的表達意義也未取得一致結論。

為達到上述研究目的，我們曾采用基因定點誘變的方法［1-3］，構建了核定位信號突變的P21真核表達載體，轉染HepG2細胞，觀察轉染的HepG2細胞周期及凋亡率的改變，進一步了解P21亞細胞定位與其功能活性的關系。

我們通過觀察肝硬化基礎上發生的原發性肝細胞癌患者，其肝癌組織、癌旁組織、肝硬化組織中P21的表達情況，亞細胞定位分布，結果顯示 HCC與癌旁肝組織P21的表達無統計學意義，但通過亞細胞定位的分析表明，HCC主要表達在細胞質，其比例可達到75.61%，而癌旁肝組織胞質表達比例為6.82%。進一步根據肝癌組織的腫瘤細胞分化程度及腫瘤轉移情況進行相關性分析，胞質P21的陽性表達與腫瘤細胞分化程度明顯負相關，胞質型P21的陽性表達與腫瘤轉移正相關。

本組研究表明，在肝硬化組織中，由于炎癥和纖維化影響，P21表達上調，但主要定位于細胞核，其表達率與炎癥及纖維化程度密切相關。而在肝癌組織，P21也可見表達上調，但主要定位于細胞質，而且胞質表達的比例與腫瘤分化程度、腫瘤轉移密切相關。因此，細胞質P21的高表達，可能有助于原發性肝癌的發生、發展。雖然P21具有廣泛的細胞周期抑制活性，但既往以P21為靶點的抗腫瘤治療，并沒有取得令人鼓舞的臨床效果，考慮可能與忽視了P21蛋白的功能狀態與其亞細胞定位密切相關，因此，從亞細胞定位角度，調整P21的抗腫瘤治療策略，也許是條可行的途徑。

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